Методы выявления: Методы выявления | Аутизм ФРЦ

Приложение 11. Методы выявления и учета общего количества и основных физиологических групп бактерий в дрожжах и сырье \ КонсультантПлюс

Приложение 11

МЕТОДЫ

ВЫЯВЛЕНИЯ И УЧЕТА ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА И ОСНОВНЫХ

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП БАКТЕРИЙ В ДРОЖЖАХ И СЫРЬЕ

Степень зараженности дрожжей и сырья определяется разработанным Ленинградским отделением ВНИИХП методом посева их на селективные агаризованные среды с нистатином. Нистатин представляет собой антибиотик, обладающий сильным противогрибковым действием. Он задерживает рост дрожжей и плесневых грибов, но не влияет на бактерии. Концентрация нистатина, полностью задерживающая рост дрожжей, равна 20 ед. антибиотика на 1 мл среды. При активности нистатина 2500 ед./мг растворяют 12 мг водорастворимого либо 120 мг спирторастворимого нистатина в 100 мл стерильной воды. Растворы нистатина могут храниться в темном холодном месте не более 2 — 3 сут.

Применение сред различного состава с добавлением нистатина позволяет раздельно учесть количество бактерий некоторых физиологических групп, наиболее часто встречающихся в дрожжевом производстве — лактобацилл, лейконостока, гнилостных бактерий, бактерий кишечной группы. Посторонние дрожжи выявляют на синтетической среде, содержащей в качестве единственного источника азота лизин.

Для выявления и учета указанных микроорганизмов применяются следующие среды:

Микроорганизмы Питательная среда

Молочнокислые бактерии Сусло-агар с мелом

(лактобациллы и лейконосток) и нистатином

Лейконосток Дрожжевой агар с сахарозой

и нистатином

Гнилостные бактерии Молочный агар с нистатином

Кишечная палочка Синтетическая среда с

индикатором (розолово-

дифференциальный агар

в модификации

Олькеницкого И.С.)

Дрожжи

общее количество Сусло-агар

посторонние Синтетическая среда

с лизином

Перед посевом пробы исследуемого материала разводят стерильной 0,1-процентной пептонной (или водопроводной) водой. 1 г мелассы разводят обычно в 10 и 100 раз.

Так как степень обсемененности дрожжей микроорганизмами разных групп неодинакова, для каждой группы подбирают определенное разведение с тем, чтобы на чашке Петри выросло 20 — 100 колоний:

┌─────────────────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐

│Выявляемые микроорганизмы│ Разведение 1 г дрожжей │

│ ├─────────────────────────┬─────────────────────────┤

│ │ ЧК и ЕЧК │ товарных │

├─────────────────────────┼─────────────────────────┼─────────────────────────┤

│Молочнокислые бактерии │100 тыс., 1 млн., 10 млн.│100 тыс., 1 млн., 10 млн.│

│Лейконосток │1 тыс., 10 тыс., 100 тыс.│10 тыс., 100 тыс. │

│Гнилостные бактерии │100, 1 тыс., 10 тыс. │1 тыс., 10 тыс., 100 тыс.│

│Кишечная палочка │100, 1 тыс. │100, 1 тыс. │

│Дрожжи │ │ │

│ общее количество │10 млн. , 100 млн. │10 млн., 100 млн. │

│ посторонние │100, 1 тыс., 10 тыс. │1 млн., 10 млн., 100 млн.│

└─────────────────────────┴─────────────────────────┴─────────────────────────┘

В стерильном стаканчике взвешивают 1 г дрожжей из середины бруска (или 1 мл бродящей жидкости). В стаканчик наливают немного стерильной воды из колбы, в которой ее содержится 100 мл. Дрожжи размешивают стерильной палочкой, суспензию переводят в ту же колбу с водой и получают разведение дрожжей 1:100. Потом суспензию последовательно разводят в стерильной воде, увеличивая разведение с каждым последующим разведением в 10 раз. При каждом пересеве нужно пользоваться новой стерильной пипеткой.

В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл исследуемой пробы соответствующего разведения, затем в чашки, предназначенные для выявления бактерий, вносят по 1 мл раствора или суспензии нистатина, стерильный мел на кончике скальпеля (при выявлении молочнокислых бактерий), вливают расплавленную и охлажденную до 40 — 55 °С питательную среду.

Выращивание ведут в термостате при 30 °С. Через 24 ч подсчитывают колонии лейконостока на дрожжевом агаре. Гнилостные бактерии в зависимости от активности их протеолитических ферментов образуют зоны просветления среды через 48 — 72 ч, молочнокислые — через 72 ч. Колонии посторонних дрожжей подсчитывают через 5 сут.

Количество выросших колоний умножают на соответствующее разведение.

Количество бактерий выражают числом клеток в 1 г прессованных дрожжей или в 1 мл культуральной жидкости, а содержание посторонних дрожжей — в процентах от общего количества дрожжевых клеток в посеве.

Мелассу считают хорошей, если в 1 г ее содержится до 2 тыс. микроорганизмов без преобладания отдельных видов. В посредственной мелассе (2 — 10 тыс. клеток) преобладают отдельные виды. В плохой меласса количество микроорганизмов превышает 10 тыс. клеток в 1 г и также преобладают отдельные виды.

При удовлетворительной работе завода в 1 г дрожжей допускается следующее содержание микроорганизмов:

┌────────────────────────────┬───────────────────────────────────┐

│ Микроорганизмы │ Дрожжи │

│ ├───────────┬───────────┬───────────┤

│ │ ЧК │ ЕЧК │ товарные │

├────────────────────────────┼───────────┼───────────┼───────────┤

│Молочнокислые, млн. │До 1 │До 10 │До 100 │

│Лейконосток │0 │0 │До 1 млн. │

│Кишечная палочка │0 │0 │0 │

│Гнилостные бактерии │До 500 │До 1000 │До 5000 │

│Посторонние дрожжи, % │0 │0,001 │До 10 │

└────────────────────────────┴───────────┴───────────┴───────────┘

Если содержание посторонних микроорганизмов превышает допустимые нормы, следует установить причины нарушений и принять меры к их устранению.

Методы выявления страхового мошенничества | Методы выявления и борьбы со страховым мошенничеством

Страхование – сфера, к которой традиционно привлечено внимание общественности. Если добровольное страхование жизни, имущества или гражданской ответственности остается частным делом компании или гражданина, то ситуация с обязательным страхованием, когда страхователь не может избежать необходимости заключения договора, требует внимания ко всем моментам, когда в результате страхового мошенничества гражданин или компания не получают причитающихся им средств страховой выплаты. Методы выявления таких ситуаций актуальны для страхователей, государственных органов – регуляторов.

Виды страхового мошенничества

Неполучение страхового возмещения из-за того, что страховая компания действует без лицензии или изначально создана в мошеннических целях, – не самый яркий пример действий, за которыми следует уголовное преследование. Страховые компании также не избавлены от риска стать жертвой мошенничества. Особенно часто граждане и юридические лица стремятся неправомерно завладеть средствами страховщиков при реализации возможностей, заложенных в ОСАГО. Сразу после принятия закона об обязательном страховании Российский Союз Автостраховщиков разработал «Концепцию организации взаимодействия страховых организаций по борьбе с мошенничеством и иными правонарушениями в автостраховании», реализация которой была запланирована где-то на период до 2005 года. В документе предусматривалось:

• снижение убыточности страхового бизнеса путем повышения степени взаимодействия с органами следствия для выявления и расследования страхового мошенничества;
• укрепление сотрудничества в целях разработки более эффективного правового преследования этого типа преступлений;
• организация кооперации и оказание помощи страховым компаниям, пострадавшим от мошенничества;
• взаимодействие с международными организациями, действующими в этой сфере.

В результате деятельности комиссии в Уголовный кодекс в 2012 году были внесены поправки, появилась статья 159.5 УК РФ «Мошенничество в сфере страхования», в которой состав расшифровался следующим образом:

• хищение чужого имущества путем инсценировки обстоятельств страхового случая или завышения суммы убытков;
• то же деяние, совершенное группой лиц.

Практика зарубежного и российского страхового рынка выработала несколько стандартных способов страхового мошенничества. При их анализе они четко разбиваются на две группы:

• преступления против страховщика;
• преступления против страхователя.

В первом случае, когда ущерб наносится страховой компании, его виновником оказываются или сотрудники (инсайдеры), или клиенты. Во втором случае круг организаторов преступления не ограничивается только самими компаниями или их сотрудниками. Здесь же присутствуют страховые брокеры или лица, создающие фиктивные страховые организации. Если выявлять конкретные составы преступлений, предусмотренных уголовным кодексом, то набирается почти все содержимое экономического блока:

• мошенничество;
• злоупотребление полномочиями;
• подкуп;
• подлог;
• присвоение или растрата;
• дача или получение взятки;
• лжепредпринимательство.

Против страховщика совершаются преступления, имеющие характер страхового мошенничества. И здесь интересна статистика, которая разделяет правонарушения по сфере, в которой осуществляется страхование:

• 62 % случаев – это мошенничества в сфере страхования автотранспорта;
• всего 10,2 % – это правонарушения, связанные со страхованием жизни и здоровья;
• 22 % – все остальные виды имущественного страхования.

С точки зрения финансовой выгоды выделяются два момента: или страхователи завышают суммы убытков, или же один и тот же риск страхуется дважды. Каждый из моментов требует собственных методов его выявления.

Но проблема состоит в том, что страховые мошенничества не ограничиваются сферой экономических правонарушений. Как показывает практика, и преступления против жизни и здоровья граждан могут иметь своей целью незаконное получение страховой выплаты. Следователи встречаются с убийствами, совершаемыми именно с этой целью, и они делятся на три группы:

• убийство застрахованного лица, при этом обстоятельства внешнего страхового случая тщательно инсценируются;
• убийство, закамуфлированное под несчастный случай;
• убийство лица, схожего по антропологическим признакам с застрахованным лицом, с целью выдачи его за страхователя.

Такие случаи единичны, в России они не составляют систему, как в других странах, где страхование жизни более распространено, но они существуют.

Субъекты страхового мошенничества

Субъектами мошенничества чаще всего становятся две группы лиц:

• страховые компании или их сотрудники, предлагающие страховые услуги без намерения произвести выплаты в предусмотренных законом или договором случаях;
• граждане и юридические лица, создающие самостоятельно страховые случаи с намерением только получить страховую выплату. Примером такой ситуации может стать поджог имущества, принятого на хранение и растраченного.

В каждой из ситуаций субъект мошенничества стремится извлечь выгоду из деяния, совершаемого с единственной корыстной целью. Сопровождать такие действия могут и другие составы преступлений, например, подлог, подделка документов, умышленная порча имущества. Если в первом случае деятельность регулятора, Центрального банка, помогла сократить количество страховых мошенничеств, то во втором случае уровень риска не снижается.

Компании в зоне риска

Предприниматели, вступающие в отношения со страховыми компаниями, должны понимать, что заключение договора страхования не всегда способно полностью обезопасить имущество. Страховщики могут найти способ не выплатить деньги или существенно занизить суммы возмещения, но выявить в этих деяниях состав страхового мошенничества сложно. А вот делами, которые связаны с причинением ущерба страховым компаниям, работающим с ОСАГО, суды завалены.

Все преступники, работающие в этой сфере, делятся на «любителей» и «профессионалов».

Первые действуют на свой страх и риск, примером может стать самоподжог застрахованного деревенского дома. От их деятельности может пострадать любая компания. Также любители могут войти в сговор с сотрудниками страховой компании и превратить один страховой случай в несколько, получив возмещение по каждому. Этот тип мошенничества невозможен без потворства ему работников страховщика.

Вторые работают на системной основе со страховыми организациями, действующими во многих регионах и специализирующимися в сфере страхования. Формируются преступные сообщества с распределенными ролями: кто-то ищет клиентов, кто-то исполняет роль фиктивного аварийного комиссара. Часто в такой группе оказывается и один или несколько сотрудников самой страховой компании. Имеет она и серьезные связи в правоохранительных структурах. Клиента из среды владельцев транспортных средств не приходится долго уговаривать – обмануть страховщика не кажется зазорным многим автомобилистам, чувствующим себя жертвами несправедливых поборов в виде ОСАГО, выплаты по которым практически никогда не покрывают реальный ущерб.

Их деятельность квалифицируется уголовным законом строже, но выявить эти преступления сложнее, благодаря системным связям организованной группы и опыту работы со стандартными методами выявления страхового мошенничества.

Методы выявления

Применение того или иного метода основывается на возможностях каждого участника страхового оборота. Понятно, что у юрисконсульта небольшой компании, изучающего договор страхования, таких возможностей существенно меньше, чем у сотрудника органов дознания или следствия, действующего в тот момент, когда совершенное мошенничество уже стало предметом расследования. При изучении ситуации в случае с ОСАГО у страховой компании очень мало времени, ей нужно заплатить возмещение в пределах контролируемых сроков, при КАСКО времени на исследование обстоятельств страхового случая может оказаться существенно больше.
Только изучение документов, связанных с конкретным страховым случаем, не исчерпывает все возможности организационных методов.

Технические и программные методы выявления

Технические и программные способы выявления страхового мошенничества наилучшим образом работают в сфере страхования гражданской ответственности при выявлении тех ДТП, которые конструировались только в целях присвоения средств страховых компаний. Службы безопасности должны иметь в своем арсенале технологии, которые позволяют методами программирования или физических изменений в полном объеме реконструировать события, происходящие на конкретном месте ДТП. Некоторый блок таких технологий принят на вооружение Национальным центром анализа автомобильных аварий США, но ими пользуются и отечественные страховщики. Программный продукт, разработанный в этих целях, имеет высокую стоимость, а его эффективная работа осложняется отсутствием специализированных библиотек, в которые внесены геометрические данные автомобилей, эксплуатируемых в России, как отечественных, так и зарубежных, разработанных для российского рынка.

Необходима разработка отечественных программных продуктов, которые могли бы:

• проектировать предполагаемую деформацию транспортного средства в условиях конкретного столкновения;
• рассчитывать траекторию движения транспортных средств в момент столкновения, определять возможные повреждения;
• иметь два уровня обработки информации, на первом из которых обстоятельства ДТП будут реконструироваться инженерными методами, на втором будут рассчитывать параметры взаимодействия конструкций транспортных средств с точки зрения физических законов.

Для реализации такого программного продукта необходимо создание библиотеки данных, включающих все параметры автомобилей, ходящих по российским дорогам. Но она, при наличии грамотного и обученного персонала, сможет почти полностью исключать случаи выплаты страхового возмещения по сознательно создаваемым ДТП. Использование программы отечественной разработки позволит в большей степени легитимизировать ее выводы, так как данные, предложенные иностранными программными продуктами, будут скептически восприниматься российскими судебными органами.

Оперативные методы выявления

Оперативные способы выявления страхового мошенничества доступны не только органам дознания. Иногда юридическому лицу, страховой фирме имеет смысл привлечь к сотрудничеству компанию, оказывающую профессиональные услуги в сфере безопасности. Выезд специалиста на место ДТП должен сопровождаться использованием технических средств, которые помогут зафиксировать доказательственную базу. Среди них: 

• фотосъемка;
• изучение присланных клиентом фотографий при помощи средств ExifTool, которые дают возможность точно восстановить обстоятельства события;
• трасологическая экспертиза;
• реконструкция места происшествия;
• экспертиза, например, дактилоскопическая. Она применяется при инсценированном хищении элементов автомобиля, мошенники иногда забывают стереть отпечатки пальцев.

Так, зачастую следы аварии наносятся на автомобиль, представленный на экспертизу, при помощи пластилина, и их можно обнаружить. Даже в ситуации отсутствия времени и имея на руках отказ в возбуждении уголовного дела, его можно оспорить из-за неточностей в оформлении и продлить срок, в течение которого можно установить мошенничество. Если снова будет отказано в возбуждении, это опять оспаривается, и такой организационный метод отказа в выплате помогает продлить период отказов до момента истечения срока исковой давности.

Преследование страховых мошенничеств требует нахождения в штате компании обычных сотрудников служб безопасности. Изучение актуальной судебной практики также сможет помочь выявить сложные ситуации в деятельности компании, имеющие схожесть со страховым мошенничеством.

методов обнаружения | Bio-Rad

В этом разделе представлен обзор различных методов обнаружения, используемых для визуализации белков после иммунодетекции. Теория, лежащая в основе нескольких широко используемых методов обнаружения вестерн-блоттинга, таких как колориметрический, хемилюминесцентный и флуоресцентный методы, а также других менее распространенных методов, таких как хемифлуоресценция, авторадиография и методы мечения иммунозолотом, освещена ниже.

Связанные темы : Отбор и разведение антител, снятие и повторное зондирование мембран и вестерн-блоттинг.

Page Contents

 

Связанные с мембраной белки обычно выявляют с помощью вторичных антител, меченных радиоизотопами или коллоидным золотом, или конъюгированных с флуоресцентными молекулами (флуорофорами) или ферментом, таким как щелочная фосфатаза (ЩФ) или пероксидазы хрена (HRP). Ранние системы блоттинга использовали реагенты, меченные

125 I, аналогичные тем, которые используются в радиоиммуноанализе. Эти системы дают чувствительные результаты, но особые проблемы с обращением и утилизацией ¹²⁵ Реагенты I не рекомендуют дальнейшее использование этого метода. С тех пор был разработан ряд ферментных систем и реагентов для обнаружения.

Механизм обнаружения хим. В каждом методе вестерн-блоттинга обнаруживаемый сигнал генерируется после связывания антитела, специфичного к интересующему белку. При колориметрическом обнаружении ( A ) сигнал представляет собой окрашенный осадок. При хемилюминесценции ( B ) сама реакция испускает свет. При обнаружении флуоресценции (

C ), антитело метят флуорофором.

Наиболее распространенные методы обнаружения используют вторичные антитела, конъюгированные с AP или HRP. В этих методах при добавлении субстрата фермента на блоте выпадает либо окрашенный осадок (колориметрическое определение), либо образуется хемилюминесцентный или флуоресцентный продукт, а световой сигнал фиксируется на пленке или с помощью цифровой системы формирования изображения (см. рис. выше). ). Вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, набирают популярность и могут быть непосредственно визуализированы и захвачены с помощью совместимого устройства визуализации без необходимости в дополнительном жидком субстрате (см. Обнаружение флуоресценции).

Вернуться к началу

 

Колориметрические системы HRP
Системы HRP имеют преимущество перед другими системами обнаружения в том, что и ферментный конъюгат, и субстраты для колориметрического обнаружения являются экономичными. Наиболее распространенными субстратами для колориметрического HRP являются 4-хлор-1-нафтол (4CN) (Hawkes et al., 1982) и 3,3′-диаминобензидин (DAB) (Tsang et al., 1985) (см. рисунок ниже). Некоторыми ограничениями колориметрических систем обнаружения HRP являются пониженная чувствительность по сравнению с системами колориметрического обнаружения AP, обесцвечивание пятен при воздействии света, ингибирование активности HRP азидом и неспецифическое осаждение цвета.

Ферменты, такие как AP и HRP, превращают несколько субстратов в окрашенный осадок (см. таблицу ниже). По мере накопления осадка на пятне появляется цветной сигнал, который хорошо виден на пятне невооруженным глазом. Ферментативную реакцию можно отслеживать и останавливать, когда достигается желаемый сигнал по сравнению с фоном. Колориметрическое обнаружение проще в использовании, чем методы обнаружения на основе пленки, которые требуют проб и ошибок при определении подходящего времени экспозиции и используют дорогостоящие материалы, такие как рентгеновская пленка и химикаты для фотолаборатории. Колориметрическое обнаружение считается методом средней чувствительности по сравнению с радиоактивным или хемилюминесцентным обнаружением.

Опции колориметрического обнаружения с HRP. DAB и 4CN обычно используются в качестве хромогенных субстратов для HRP. В присутствии H ₂ O ₂ HRP катализирует окисление субстрата в продукт, который виден на блоте. Слева — реакция с DAB; правильно, реакция с 4CN.

Колориметрические системы AP

Колориметрические системы AP используют растворимый 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) и нитросиний тетразолий (NBT) в качестве субстратов для получения стабильного продукта реакции, который не исчезнет (см. рисунок). ниже). AP легко инактивируется воздействием кислых растворов. Множественное зондирование одной и той же мембраны альтернативными зондами антител может быть выполнено с использованием субстратов, дающих разные цвета, например синий и красный (Blake et al. 19).84, Тернер, 1983 г., Куриен и Скофилд, 2003 г.).

АП колориметрическое проявление. В колориметрической системе AP катализирует субстраты BCIP и NBT с образованием окрашенного осадка, визуализирующего белок на вестерн-блоттинге. Сначала происходит дефосфорилирование BCIP с помощью AP с образованием промежуточного соединения бромхлориндоксила. Затем индоксил окисляется NBT с образованием индигоидного красителя (фиолетовый осадок). NBT также восстанавливается индоксилом, открывая тетразольное кольцо с образованием нерастворимого диформазана (синий осадок). Комбинация индигоидного красителя BCIP и нерастворимого формазана NBT образует осадок пурпурно-синего цвета.

Колориметрические и хемилюминесцентные блоты. Разведение слитого белка GST было иммунодетектировано с использованием моноклонального антитела, специфичного к GST, с последующим A , AP-конъюгированным вторичным антителом и субстратом BCIP/NBT для колориметрического детектирования, или B , вторичным антителом, конъюгированным с HRP, и Хемилюминесцентный субстрат Immun-Star™ WesternC™ для обнаружения хемилюминесценции.

Колориметрические системы обнаружения

.

Детектор и подложка
Наборы для иммуноблоттинга	Наборы	Сухой порошок
Колориметрический HRP	4CN	500 стр	Фиолетовый	х	х	х	Быстрое развитие цвета, низкая стоимость, низкая фоновая ферментативная активность
Колориметрический HRP	ДАБ	500 стр	Коричневый			х	Нерастворимый продукт, легко образующий хелат с четырехокисью осмия. Чувствительность может быть дополнительно повышена за счет добавления металлов
Колориметрический HRP	Опти-4CN™	100 стр	Фиолетовый	х			Высокая чувствительность, невыцветающий цвет, низкий фон
Колориметрический HRP	Усиленный Opti-4CN	5 стр.	Фиолетовый	х			Наилучшая доступная чувствительность — равна хемилюминесценции; комплект содержит все необходимые компоненты
Колориметрический AP	БКИП/НБТ	100 стр	Фиолетовый	х	х	х	Высокая чувствительность

Предварительно смешанный и индивидуальный колориметрический субстрат
Также доступны предварительно смешанные наборы ферментных субстратов и реагенты для проявления, включая порошкообразные реагенты для проявления цвета 4CN и DAB. Готовые наборы удобны и надежны, они снижают воздействие опасных реагентов, используемых для проявления окраски белковых пятен.

Наборы для анализа Immun-Blot ^®
Наборы для анализа Immun-Blot содержат реагенты, необходимые для стандартного колориметрического обнаружения HRP/4CN или AP на вестерн-блотах, а также предварительно смешанные буферы и ферментные субстраты. Кроме того, эти наборы содержат вторичное антитело, конъюгированное либо с HRP, либо с AP. Все компоненты набора проходят индивидуальную проверку качества при использовании в блоттинге. В каждый комплект входит руководство по эксплуатации с тщательно проверенным протоколом и руководство по устранению неполадок, упрощающее иммунологическое обнаружение.

Opti-4CN™ и Amplified Opti-4CN Субстрат и наборы для обнаружения
Колориметрическое обнаружение HRP с помощью 4CN уже обеспечивает очень низкий фон и чувствительность обнаружения около
500 пг антигена. Набор Bio-Rad Opti-4CN повышает чувствительность обнаружения до 100 пг. Opti-4CN доступен в виде набора предварительно смешанных субстратов или в сочетании с HRP-конъюгированным антителом в наборе для обнаружения.

Субстрат Amplified Opti-4CN и наборы для обнаружения основаны на запатентованных HRP-активируемых реагентах для амплификации от Bio-Rad. Эти наборы обеспечивают колориметрическое обнаружение до 5 пг, что соответствует или даже превышает чувствительность, достигаемую с помощью радиометрических и некоторых хемилюминесцентных систем, но без затрат или времени, связанных с проявкой блотов в темной комнате.

Вернуться к началу

 

Хемилюминесценция возникает, когда химический субстрат катализируется ферментом, таким как AP или HRP, и производит свет в качестве побочного продукта [см. рисунки выше]. Световой сигнал можно зафиксировать на рентгеновской пленке или с помощью устройства формирования изображения с зарядовой связью (ПЗС), такого как система ChemiDoc XRS+ и система ChemiDoc MP. Эта технология легко адаптируется к существующим процедурам вестерн-блоттинга, поскольку при хемилюминесценции для активации светового сигнала используются антитела, конъюгированные с ферментами. Методы блокировки и промывки являются знакомыми процедурами.

Преимущества хемилюминесцентного вестерн-блоттинга по сравнению с другими методами заключаются в скорости и чувствительности (см. таблицу ниже). Этот метод идеально подходит для ПЗС-изображения, при котором обычно время экспозиции блотов составляет от 5 секунд до 5 минут, в зависимости от чувствительности подложки. Это большое улучшение по сравнению с системами ¹²⁵ I, которым может потребоваться до 48 часов для экспонирования пленки. С помощью этих систем возможно обнаружение белка в количествах до фемтограмм. Это более чувствительно, чем у большинства колориметрических систем, и сравнимо с радиоизотопным обнаружением. Чувствительность обнаружения зависит от аффинности белка, первичного антитела, вторичного антитела и субстрата HRP и может варьироваться от одного образца к другому.

Системы обнаружения хемилюминесценции

Метод обнаружения	Подложка	Чувствительность обнаружения	Опции продукта	Преимущества	Недостатки
Хемилюминесцентный HRP
Иммун-Стар HRP	Люминол	1–3 стр.	Конъюгаты	Короткая (30 с) выдержка	Азид ингибирует активность ферментов
			Подложка HRP	Длительность сигнала 6–8 ч
			Наборы Immun-Blot	Совместим с ПВДФ и нитроцеллюлозой
				Рабочий раствор стабилен в течение 24 часов при комнатной температуре
Иммун-Стар ВестернC	Люминол	Фемтограмма	Конъюгаты	Длительность сигнала до 24 часа	Азид ингибирует активность ферментов
				Оптимизирован для ПЗС-сканеров
				Высокая чувствительность
Хемилюминесцентный АП
Иммун-Стар АП	CDP- Звезда	10 стр.	Конъюгаты	Выдержка от 30 с до 5 мин	Активность эндогенной фосфатазы может приводить к ложноположительным результатам
			Подложка AP	Длительность сигнала до 24 часа
			Наборы для иммуноблоттинга	Блот можно повторно активировать

Еще одним преимуществом хемилюминесцентного обнаружения является безопасность. У него нет проблем с безопасностью, связанных с обнаружением изотопов, таких как облучение персонала, высокая стоимость и экологические проблемы.

Наборы для хемилюминесценции Immun-Star™
Наборы Immun-Star включают субстрат CDP-Star (активируется AP) или люминол (активируется HRP) и дают сильный сигнал как на нитроцеллюлозе, так и на PVDF. Световой сигнал, генерируемый наборами Immun-Star, не только обеспечивает быстрое воздействие, но и длится до 24 часов (наборы для хемилюминесценции Immun-Star™ WesternC™ и наборы Immun-Star™ AP) после первоначальной активации блота. Эти пятна можно реактивировать со свежим субстратом даже через несколько недель после того, как сигнал был исчерпан. Они также могут быть раздеты и подвергнуты повторному зондированию несколько раз.

Набор для хемилюминесценции Immun-Star WesternC предназначен для использования со стандартами Precision Plus Protein™ WesternC™ и системами визуализации CCD. Он обеспечивает чувствительность на уровне фемтограмм и совместимость с любым HRP-конъюгированным антителом (см. рисунок ниже). Интенсивность сигнала оптимизирована для ПЗС-изображения.

Обнаружение антигена и стандартов Precision Plus Protein WesternC с использованием набора для обнаружения хемилюминесценции Immun-Star WesternC . Белки и 5 мкл белковых стандартов (дорожка 1) и серия разведений из 9Лизат клеток 0338 E. coli (дорожки 2–6) подвергли электрофорезу в 4–20% геле Criterion™ и перенесли на нитроцеллюлозную мембрану. Блот исследовали антителом, специфичным к белкам слияния GST, а затем вторичным антителом, конъюгированным с HRP, и конъюгатом StrepTactin-HRP. После 5-минутной инкубации в растворе для обнаружения Immun-Star WesternC блот визуализировали на устройстве для визуализации ChemiDoc XRS+ в течение 5 секунд.

Вернуться к началу

 

При флуоресцентной детекции во время иммунодетекции используются первичные или вторичные антитела, меченные флуорофором. Источник света возбуждает флуорофор, и испускаемый флуоресцентный сигнал захватывается камерой для получения конечного изображения. При флуоресценции фотон высокой энергии (hv _ex ) возбуждает флуорофор, заставляя его покинуть основное состояние (S ₀ ) и перейти в состояние с более высокой энергией (S’ ₁ ). Часть этой энергии рассеивается, позволяя флуорофору перейти в расслабленное возбужденное состояние (S ₁ ). Испускается фотон света (hv _ex ), возвращающий флуорофор в основное состояние. Испускаемый фотон имеет более низкую энергию (более длинную длину волны) из-за рассеяния энергии в возбужденном состоянии.

При использовании обнаружения флуоресценции учитывайте следующие оптические характеристики флуорофоров для оптимизации сигнала:

• Квантовый выход — эффективность испускания фотона после поглощения фотона. Процессы, которые возвращают флуорофор в основное состояние, но не приводят к излучению флуоресцентного фотона, снижают квантовый выход. Флуорофоры с более высоким квантовым выходом обычно ярче
• Коэффициент экстинкции — мера того, насколько хорошо флуорофор поглощает свет на определенной длине волны. Поскольку поглощение зависит от длины пути и концентрации (закон Бера), коэффициент экстинкции обычно выражается в см ^-1 М ^-1 . Как и в случае с квантовым выходом, флуорофоры с более высокими коэффициентами экстинкции обычно ярче
• Стоксов сдвиг — разность максимальных длин волн возбуждения и испускания флуорофора. Поскольку некоторая энергия рассеивается, пока флуорофор находится в возбужденном состоянии, испускаемые фотоны имеют меньшую энергию (длину волны больше), чем свет, используемый для возбуждения. Большие стоксовы сдвиги минимизируют перекрытие между длинами волн возбуждения и излучения, увеличивая обнаруженный сигнал
• Спектры возбуждения и излучения — спектров возбуждения представляют собой графики интенсивности флуоресценции флуорофора в диапазоне длин волн возбуждения; спектры испускания показывают длины волн испускания флуоресцентной молекулы. Выберите флуорофоры, которые могут быть возбуждены источником света в тепловизоре и имеют спектры излучения, которые могут быть захвачены прибором. При выполнении мультиплексных вестернов выбирайте флуорофоры с минимально перекрывающимися спектрами, чтобы избежать перекрестных помех в каналах

В настоящее время доступны несколько флуорофоров, охватывающих широкий диапазон длин волн возбуждения и испускания, в том числе некоторые на основе органических красителей (например, цианин и флуоресцеин), нанокристаллов полупроводникового материала и природных флуоресцентных белков (например, фикобилипротеинов, таких как фикоэритрин и аллофикоцианин).

Флуоресцентное обнаружение (см. рисунок ниже) имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами:

• Мультиплексирование — использование нескольких флуорофоров разного цвета для одновременной детекции нескольких белков-мишеней на одном и том же пятне. При обнаружении нескольких белков в флуоресцентном мультиплексном вестерн-блоттинге убедитесь, что флуоресцентные сигналы, генерируемые для каждого белка, могут быть дифференцированы. Используйте первичные антитела от разных видов хозяев (например, мыши и кролика) и вторичные антитела, которые перекрестно абсорбируются против других видов, чтобы избежать перекрестной реактивности. Используйте флуорофоры, конъюгированные со вторичными антителами с разными спектрами, чтобы их можно было оптически отличить друг от друга, чтобы избежать кросс-канальной флуоресценции
• Динамический диапазон — 10-кратный больший динамический диапазон по сравнению с хемилюминесцентным обнаружением и, следовательно, лучшая линейность в пределах обнаружения
• Стабильность — многие флуоресцентные молекулы стабильны в течение длительного периода времени, что позволяет сохранять блоты для повторного визуализации в более поздние сроки — часто спустя недели или месяцы — без значительной потери сигнала. Большинство методов флуоресценции также совместимы с протоколами стриппинга и повторного зондирования, при условии, что блоты не высыхают между последовательными раундами детекции вестерн-блоттинга

 

Мультиплексная флуоресцентная детекция серии двукратных разведений двух белков, GST (красный) и ингибитора трипсина сои (зеленый). Начальная концентрация составляла 500 нг каждого белка. В качестве маркеров использовали стандарты Precision Plus Protein™ WesternC™.

Вернуться к началу

 

Биолюминесценция
Биолюминесценция — это естественное излучение света многими организмами. Биолюминесцентные системы различаются строением и функцией ферментов и кофакторов, участвующих в процессе, а также механизмом светогенерирующих реакций. Биолюминесценция также используется в качестве метода обнаружения белков и нуклеиновых кислот на мембране.

Обнаружение биолюминесценции включает инкубацию мембраны (со связанным комплексом антиген-антитело-фермент) в биолюминогенном субстрате и одновременное измерение испускаемого света (см. рисунок ниже). Субстрат, участвующий в этой системе обнаружения, представляет собой производное на основе люциферина. Обнаружение света выполняется с помощью камеры, подсчитывающей фотоны, и блотированные белки визуализируются в виде ярких пятен. Этот метод похож на хемилюминесценцию по своей чувствительности и скорости обнаружения, но он не получил широкого распространения, и в продаже имеется несколько биолюминогенных субстратов. ПВДФ является предпочтительной мембраной для обнаружения биолюминесценции, поскольку нитроцеллюлозные мембраны могут содержать вещества, ингибирующие активность люциферазы.

Хемифлуоресценция
Хемифлуоресценция – это ферментативное превращение субстрата в флуоресцентный продукт (см. рисунок ниже). Флуорогенные соединения (нефлуоресцентные или слабофлуоресцентные вещества, которые могут быть преобразованы в флуоресцентные продукты) доступны для использования с широким спектром ферментов, включая AP и HRP. Фермент отщепляет фосфатную группу от флуорогенного субстрата с образованием сильно флуоресцентного продукта. Флуоресценцию можно обнаружить с помощью устройства для визуализации флуоресценции, такого как система PharosFX или система ChemiDoc MP. Хемифлуоресценция обеспечивает стабильный флуоресцентный продукт реакции, поэтому пятна можно сканировать позднее. Этот метод также совместим со стандартными процедурами зачистки и повторного зондирования.

Авторадиография
Гамма-излучающий радиоизотоп ¹²⁵ I можно использовать для мечения лизинов в иммуноглобулинах для радиометрического обнаружения антигена (см. рисунок ниже). Прямое иммунологическое обнаружение (с использованием меченых вторичных антител) всего 1 пг точечного иммуноглобулина возможно с помощью зондов с высокой удельной активностью ¹²⁵ I. Пятна с радиоактивной меткой можно обнаружить с помощью рентгеновской пленки, метода, известного как авторадиография. Из-за опасностей, связанных с радиоактивно мечеными конъюгатами, популярность авторадиографии снижается в пользу колориметрических и хемилюминесцентных методов.

Маркировка Immunogold
Методы обнаружения Immunogold используют меченые золотом вторичные антитела для обнаружения антигена. Поскольку этот метод имеет относительно низкую чувствительность, а сигнал не является постоянным, в качестве средства усиления сигнала были разработаны методы усиления серебром, аналогичные тем, которые описаны для окрашивания общего белка коллоидным золотом (см. рисунок ниже). При использовании серебра на пятне создается фон, а чувствительность увеличивается в 10 раз, что эквивалентно колориметрическому обнаружению AP и в несколько раз более чувствительно, чем авторадиография.

Механизм обнаружения хим. При биолюминесцентном обнаружении ( A ) сама ферментативная реакция излучает свет, а при хемифлуоресцентном ( B ) продукт реакции флуоресцентный. При авторадиографии ( C ) вторичное антитело само несет радиоактивную метку, а при мечении иммунозолотом ( D ) вторичное антитело метят золотом, и сигнал усиливается осаждением серебра.

Наверх

 

Bayer EA and Wilchek M (1980). Использование авидин-биотинового комплекса в качестве инструмента в молекулярной биологии. Методы Biochem Anal 26, 1–45.

Blake MS et al. (1984). Быстрый и чувствительный метод обнаружения антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой, на Вестерн-блоттинге. Анальная биохимия 136, 175–179.

Чайет Л. и Вольф Ф.Дж. (1964 г.). Свойства стрептавидина, биотинсвязывающего белка, продуцируемого Streptomyces. Arch Biochem Biophys 106, 1–5.

Guesdon J-L et al. (1979). Использование авидин-биотинового взаимодействия в иммуноферментных методиках. J Histochem Cytochem 27, 1131–1139.

Hawkes R et al. (1982). Дот-иммуноанализ на моноклональные и другие антитела. Анальная биохимия 119, 142–147.

Хсу С.М. и др. (1981). Использование авидин-биотин-пероксидазного комплекса (АВС) в иммунопероксидазных методиках: сравнение процедур АВС и немеченых антител (РАР). J Histochem Cytochem 29, 577–580.

Куриен Б.Т. и Скофилд Р.Х. (2003 г.). Белковый блоттинг: обзор. J Immunol Methods 274, 1–15.

Цанг В.К. и др. (1985). Иммуноэлектротрансферный блот с ферментом (EITB). В ферментативно-опосредованном иммуноанализе. Т. Т. Нго и Х.М. Ленхофф, ред. (Нью-Йорк: Plenum Press), стр. 389–414.

Вернуться к началу

Сопутствующее содержимое

• Документы
• Протоколы

Документы

Номер Описание Опции

5881

Усовершенствованный мультиплексный флуоресцентный вестерн-блоттинг, версия A

2895

Руководство по блоттингу белков, версия C

3179

Флуоресцентные наночастицы для вестерн-блоттинга, версия A

5809

Визуализация хемилюминесцентных вестерн-блотов: сравнение цифровой визуализации и рентгеновской пленки, версия A

5723

Увеличение производительности вестерн-блоттинга с помощью мультиплексного флуоресцентного обнаружения, версия B

ТЕСТ

Номер Описание Опции

Номер	Описание	Опции
6216	Буферные составы для обнаружения	Нажмите, чтобы скачать
6218	Удаление блотов и повторное зондирование	Нажмите, чтобы скачать
6219	Иммунодетекция	Нажмите, чтобы скачать

Обзор технологий | Методы обнаружения

Разработаны, утверждены и задокументированы точные и достоверные методы обнаружения
при разработке каждого нового генетически модифицированного (ГМ) продукта.
Эти методы являются неотъемлемой частью разработки продукции, контроля качества и сбора нормативных данных
, а также необходимы для поддержки эффективной глобальной торговли и обеспечения соблюдения региональных нормативных рамок
.

Некоторые регулирующие органы требуют предоставления методов обнаружения, которые обнаруживают специфическую ДНК или белки
, связанные с биотехнологическим (биотехнологическим) признаком, уникальным для ГМ-продукта.
Таким образом, методы обнаружения используются для обеспечения соблюдения правил. Они также используются для
разделения и сохранения идентичности и чистоты продуктов. Обычно они являются интеллектуальной собственностью
разработчиков черт. Методы обнаружения часто предоставляются заинтересованным сторонам
, таким как производители семян, переработчики зерна, пищевые компании и другим заинтересованным сторонам, посредством лицензий или
сторонних испытательных лабораторий.

Веб-сайт CropLife International Detection Methods предоставляет заинтересованным сторонам возможность
лицензируйте эти методы у разработчика (разработчиков) признаков для проверки наличия продукта ГМ
(Принципы передачи и использования интеллектуальной собственности).

1 Типы методов обнаружения

В настоящее время широко используются два основных типа методов обнаружения генетически модифицированных продуктов. Более подробное обсуждение
см. в «Применение методов отбора проб и обнаружения в биотехнологии сельскохозяйственных растений
» (Shillito and Shan, 2022).

1.1 ДНК-методы

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является аналитическим методом, наиболее предпочтительным для обнаружения и/или количественного определения специфических последовательностей ДНК, присутствующих в продуктах ГМ. ПЦР может быть выполнена качественным способом для определения присутствия или отсутствия последовательности или количественным методом для определения количества ДНК-мишени, присутствующей в образце. «Методы ПЦР, специфичные для событий» предназначены для
обнаружения последовательностей ДНК, уникальных для конкретного ГМ-продукта. В качестве альтернативы, «методы
, специфичные для генетических элементов», предназначены для обнаружения последовательностей ДНК, которые могут быть общими для нескольких GM 9. 0041 товары.

Методы обнаружения на основе ПЦР (методы ПЦР) чрезвычайно чувствительны и, таким образом, способны обнаруживать
небольшое количество биотехнологического продукта, присутствующего в образце, обычно 1 семя из 1000 или лучше. Методы ПЦР
, включенные в базу данных CropLife International Detection Methods, проверены на соответствие международно признанным требованиям к производительности
. Эффективность и валидация методов ПЦР
описаны в международных стандартах (ISO 24276, Codex CXG74, ISO/DS 16393). Кроме того,
имеется большое количество публикаций, подробно описывающих нужды и требования
для успешного применения методов ПЦР. Примеры, написанные группой авторов из
компаний-членов CropLife International, зернотрейдеров и частных испытательных лабораторий, можно найти в Lipp et al. (2005) и Аларкон и соавт. (2019).

1.2 Белковые методы

Белковые методы обнаружения (белковые методы), такие как иммуноанализ, определяют
наличие или количество определенного белка в растительных тканях и производных продуктах (Lipton et al.
2000; Аларкон и др. 2019). Иммуноанализы требуют белок-специфических антител и часто используются в виде твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или тест-полосок с латеральным потоком,
также известных как устройства с латеральным потоком (LFD).

Методы обнаружения белков часто просты в использовании. LFD, например, хорошо адаптированы для использования в полевых условиях
(Grothaus et al. 2006; Alarcon et al. 2019), часто коммерчески доступны в формате комплекта
и широко используются в торговле товарами.

Методы обнаружения белков не могут отличить разные биотехнологические продукты, которые
экспрессируют один и тот же белок. Поскольку белки часто денатурируются при обработке, белковые методы
наиболее подходят для использования на необработанных или минимально обработанных материалах (например, семенах, тканях растений,
зерне, муке). Однако время от времени разрабатывались тесты для использования в конкретных обработанных материалах (Stave 2002).

2 Эталонные материалы

Стандартные материалы используются в качестве стандартов при калибровке метода и, если они сертифицированы, должны быть
производится в соответствии с международными стандартами (Trapmann et al. 2017) и руководствами. CropLife
International признает необходимость использования эталонных материалов для калибровки и проверки методов обнаружения
, а также для проверки квалификации лабораторий. Сертифицированные эталонные материалы

(CRM) коммерчески доступны по всему миру для всех коммерческих биотехнологических культур
, разработанных членами CropLife International. Эти справочные материалы
предлагаются для отдельных мероприятий каждой компанией через назначенных поставщиков CRM, аккредитованных ISO.

3 Ссылки

Аларкон, К.М., Шан, Г., Лейтон Д.Т., Белл, Т.А., Уипки, С., Шиллито, Р.Д. (2019).
Применение ДНК- и белковых методов детекции в сельскохозяйственной биотехнологии. J
Agric Food Chem 67(4): 1019-1028. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.8b05157

Гротхаус, Г. Д., Бандла, М., Карриер, Т., Жиру, Р., Дженкинс, Г. Р., Липп, М., Шан, Г., Стейв, Дж.
В., и Пантелла, В. (2006). Иммуноанализ как аналитический инструмент в сельскохозяйственной биотехнологии.
J АОАС Междунар. 89 (4): 913-928.

Липп М., Шиллито Р., Жиру Р., Шпигельхальтер Ф., Чарльтон С., Пинеро Д. и Сонг П. (2005).
Технология полимеразной цепной реакции как аналитический инструмент в сельскохозяйственной биотехнологии. J
AOAC Междунар. 88(1):136-155.

Lipton, C.R., Dautlick, J.X., Grothaus, G.D., Hunst, P.L., Magin, K.M., Mihaliak, C.A.,
Rubio, F.M., and Stave, J.W. (2000). Руководство по валидации и использованию иммунологических анализов для определения интродуцированных белков в биотехнологически улучшенных культурах и пищевых продуктах
Ингредиенты. Фуд Агрик Иммунол. 12(2): 153-164. https://doi.org/10.1080/095401000404094

Шиллито Р. и Шан Г. (2022) Применение методов отбора проб и обнаружения в сельскохозяйственной
биотехнологии растений.