Методика лиепинь бланк: Методика с. Лиепинь для изучения устойчивости, распределения и переключения внимания

Опубликовано 07.09.197128.07.2021 автором alexxlab

Содержание

Методика с. Лиепинь для изучения устойчивости, распределения и переключения внимания

Цель: изучение устойчивости, распределения и переключения внимания.

Предлагается бланк с изображением знакомых предметов трех видов (грибы, мячи, ели), расположенных по восемь в каждом ряду.

Для оценки устойчивости внимания дается задание зачеркнуть все мячи.

Для оценки распределения и переключения внимания надо вычеркнуть ели красным карандашом, а мячи – синим.

Обработка результатов: выполнение задания ниже 50% результата соответствует низкому уровню развития внимания, что может свидетельствовать о наличии ЗПР.

Особенности выполнения методики. При выполнении данного задания дети с ЗПР сталкиваются с трудностями удержания инструкции до конца выполняемой деятельности, что выражается в низком уровне распределения внимания между двумя предметами и переключении с одного предмета на другой.

Дети с ЗПР отличаются крайней неустойчивостью внимания, неспособностью к длительному напряжению и концентрации внимания без игровой мотивации.

Методика Пьерона — Рузера

Цель

Методика дает представление о скорости и качестве формирования простого навыка, усвоения нового способа действий, позволяет получить информацию об объеме и устойчивости произвольного внимания, о развитии моторики руки.

Диапазон применения дети старшего дошкольного и младшего школьного возраста.

Оборудование

Для выполнения методики используется стандартный бланк, содержащий кружки, квадраты, ромбы и треугольники, выстроенные в строчки и чередующиеся в случайном порядке (см. Приложение N 6)

Процедура эксперимента

Перед ребенком кладется чистый бланк, и психолог, заполняя пустые фигурки образца, говорит: «Смотри, вот в этом квадратике я поставлю точку, в треугольнике — вот такую черточку (вертикальную), круг оставлю чистым, ничего в нем не нарисую, а в ромбе — вот такую черточку (горизонтальную).

Все остальные фигуры ты заполнишь сам, точно так же, как я тебе показал» (еще раз повторить, где и что нарисовать). После того, как ребенок приступил к работе, психолог включает секундомер и фиксирует количество знаков, заполненных ребенком за 1 минуту (всего дается 3 минуты), — отмечает точкой или чертой прямо на бланке.

Желательно фиксировать (хотя бы приблизительно), с какого момента ребенок начинает работать по памяти, то есть без опоры на образец. В протоколе необходимо отмечать, как ребенок заполняет фигуры: старательно, аккуратно или небрежно, так как это отражается на темпе работы.

Обработка результатов

При обработке данных учитывается общее количество заполненных фигур, их число за каждую минуту, количество ошибок.

Хорошим результатом считается:

— заполнение в среднем от 70 до 86 фигур за 3 минуты;

— быстрое запоминание условных обозначений;

— после первой заполненной строчки ребенок перестает смотреть на образец;

— ошибки — в незначительном количестве (1-2 за 3 минуты).

Заключительная беседа

Включена в структуру исследования с тем, чтобы выяснить, насколько критичен ребенок в оценке собственных достижений.

Ребенку задаются вопросы в такой последовательности:

— «Понравилась тебе эта работа?»

— «Тебе было интересно?»

— «Что было интереснее всего?»

— «Что было трудно? Что легко?»

После того, как ребенок ответил на эти вопросы, его спрашивают: «Какую отметку ты бы сам себе поставил?»

Время, затрачиваемое на заключительную беседу, равняется в среднем 3 — 4 минутам.

Примечание

В большинстве случаев дети, легко справившиеся с большинством заданий, работавшие серьезно и старательно, несколько занижают оценку собственных достижений, придавая большое значение допущенным ошибкам. Дети же, испытавшие в ходе исследования частые затруднения и допускавшие много ошибок, напротив, обнаруживали тенденцию к явному завышению оценки качества своей деятельности, однако после напоминания психологом об имевших место трудностях понижали оценку до более или менее объективного уровня.

В случае неполадок обращайтесь на [email protected].

Корректурная проба (Тест Бурдона)

Назначение теста

Исследование степени концентрации и устойчивости внимания.

Описание теста

Обследование проводится с помощью специальных бланков с рядами расположенных в случайном порядке букв (цифр, фигур, может быть использован газетный текст вместо бланков). Исследуемый просматривает текст или бланк ряд за рядом и вычеркивает определенные указанные в инструкции буквы или знаки.

Инструкция к тесту

«На бланке с буквами вычеркните, просматривая ряд за рядом, все буквы «Е». Через каждые 60 секунд по моей команде отметьте вертикальной чертой, сколько знаков Вы уже просмотрели (успели просмотреть)».

Примечание: возможны другие варианты проведения методики: вычеркивать буквосочетания (например, «НО») или вычеркивать одну букву, а другую подчеркивать.

Тестовый материал

Примечание: инструкция к детскому бланку (там где листики и домики) Корректурной пробы (Тесту Бурдона) – “Нарисуй окошко у каждого домика и веточку у каждого листика”.

Обработка результатов теста

Результаты пробы оцениваются по количеству пропущенных незачеркнутых знаков, по времени выполнения или по количеству просмотренных знаков. Важным по казателем является характеристика качества и темпа выполнения (выражается числом проработанных строк и количеством допущенных ошибок за каждый 60-секундный интервал работы).

Концентрация внимания оценивается по формуле:

К = С² / П, где

С – число строк таблицы, просмотренных испытуемым,
П – количество ошибок (пропусков или ошибочных зачеркиваний лишних знаков).

Ошибкой считается пропуск тех букв, которые должны быть зачеркнуты, а также неправильное зачеркивание.

Устойчивость внимания оценивается по изменению скорости просмотра на протяжении всего задания.

Результаты подсчитываются для каждых 60 секунд по формуле:

A = S / t, где

А – темп выполнения,
S – количество букв в просмотренной части корректурной таблицы,
t – время выполнения.

По результатам выполнения методики за каждый интервал может быть построена «кривая истощаемости», отражающая, устойчивость внимания и работоспособность в динамике.

Показатель переключаемости внимания вычисляется по формуле:

С = (S

_o / S) * 100, где

S_o – количество ошибочно проработанных строк,
S – общее количество строк в проработанной испытуемым части таблицы.

При оценке переключаемости внимания испытуемый получает инструкцию зачеркивать разные буквы в четных и нечетных строках корректурной таблицы.

Произвольное и сознательное построение устного высказывания.

Задача: «Давай поиграем в игру «Запрещенные слова»? Я буду спрашивать тебя о чем-либо, а ты мне должен отвечать, не употребляя при составлении предложения запрещенные слова».

Что любит зайчик? (запрещенные слова: зайчик, морковь).

Что делает собака? (запрещенные слова: собака, лает). Какая лиса? (запрещенные слова: лиса, хитрая).

Оценка теста: 2 верных ответа (ответ должен быть в виде предложения, т. е. хотя бы два связных слова).

Диагностика познавательного развития детей с ЗПР

Диагностика познавательного развития детей младшего школьного возраста с ЗПР

Для диагностики познавательного развития детей младшего школьного возраста с ЗПР могут быть использованы следующие тесты: устойчивость, распределение и переключение внимания — методика С. Лиепинь; схематическое мышление — тест Когана; логичность мышления — «Обобщение понятий», «Конкретизация понятий», «Классификация», «Сравнение»; произвольность — тест «Запрещенные слова»; речевое развитие — методика Эббингауза, ассоциативный эксперимент.

Методика С. Лиепинь

Цель — изучение устойчивости, распределения и переключения внимания.

Для оценки устойчивости внимания дается задание зачеркнуть все мячи.

Для оценки распределения и переключения внимания надо вычеркнуть ели красным карандашом, а мячи — синим.

Обработка результатов: выполнение задания ниже 50% результата соответствует низкому уровню развития внимания, что может свидетельствовать о наличии ЗПР.

Особенности выполнения методики. При выполнении данного задания дети с ЗПР сталкиваются с трудностями удержания инструкции до конца выполняемой деятельности, что выражается в низком уровне распределения внимания между двумя предметами и переключении с одного предмета на другой. Дети с ЗПР отличаются крайней неустойчивостью внимания, неспособностью к длительному напряжению и концентрации внимания без игровой мотивации.

Тест Когана

Цель — исследование схематического мышления.

Стимульный материал: таблица с разными геометрическими фигурами и образцами разных цветов, отдельные карточки с теми же фигурами разных цветов.

Тест проводится в два этапа.

Инструкция 1: Разложи карточки по цвету или по форме.

Инструкция 2: Посмотри на таблицу и разложи карточки так, чтобы каждая попала в свою клеточку.

Обработка результатов: выполнение задания ниже 50% результата соответствует низкому уровню развития схематического мышления, что может свидетельствовать о наличии ЗПРОсобенности выполнения методики. У детей с ЗПР возникают затруднения при систематизации карточек одновременно по двум сенсорным эталонам. Дети с ЗПР показывают неспособность к целостному восприятию, для них характерны затруднения, связанные с классификацией фигур, незначительные ошибки при сходности сенсорных эталонов (путаница цветов).

Обобщение понятий

Цель — исследование логичности мышления.

Стимульный материал: набор близких понятий.

Детям дается задание на обобщение — предлагается «назвать одним словом» 10 рядов конкретных понятий:

Шкафы, кровати, стулья.

Футболки, брюки, куртки.

Сапоги, туфли, тапочки.

Васильки, ландыши, розы.

Дубы, ёлки, берёзы.

Вороны, голуби, утки.

Смородина, малина, клубника.

Картошка, морковь, помидоры.

Яблоки, груши, мандарины.

Моряки, лётчики, артиллеристы.

Обработка результатов: выполнение задания ниже 50% результата соответствует низкому уровню развития логичности мышления, что может свидетельствовать о наличии ЗПР.

Особенности выполнения методики. Дети с ЗПР чаще всего приводят обобщения на интуитивно-практическом уровне:

Шкафы, кровати, стулья — квартира.

Футболки, брюки, куртки — одевают.

Васильки, ландыши, розы — весна.

Дубы, ёлки, берёзы — улица.

Вороны, голуби, утки — летают.

Смородина, малина, клубника — еда.

Картошка, морковь, помидоры — овощи.

Яблоки, груши, мандарины — вкусная еда.

Моряки, лётчики, артиллеристы — взрослые.

Дети с ЗПР при обобщении допускают ошибки в расширении или сужении обобщающего слова, описательном характере обобщения, недостаточности анализа объектов, их существенных признаков.

Классификация

Цель — исследование логичности мышления

Стимульный материал: набор16 карточек с изображением животных, мебели, фруктов и овощей.

Инструкция: разложи картинки на четыре группы. В каждой группе картинки должны подходить друг к другу так, чтобы их можно было назвать «одним словом». Обработка результатов: выполнение задания ниже 50% результата соответствует низкому уровню развития логичности мышления, что может свидетельствовать о наличии ЗПР.

Особенности выполнения методики. Дети с ЗПР не могут объяснить свои действия и ответы.

Сравнение

Цель — исследование логичности мышления

Стимульный материал: пять пар слов.

Инструкция: сравни слова, чем они похожи и различаются.

Бабочки — ласточки.

Яблони — берёзы.

Лисы — собаки.

Цветы — деревья.

Рыбы — птицы.

Особенности выполнения методики. Дети с ЗПР охотнее выделяют различия, чем сходства; отличаются непланомерным анализом, его односторонностью.

При объявлении сходства и различия выделяют в основном несущественные признаки, например: лисы — собаки: у них уши, хвосты, яблони — берёзы: зеленые, растут в лесу, цветы — деревья: их можно поставить в вазу.

При самостоятельной работе детям предлагался материал для этих видов деятельности.

Экспертами в данном виде деятельности выступали педагоги. применялась бальная система: 5 балов – полностью справился с заданием; 4 балла – одна ошибка; 3 балла – две ошибки; 2 балла – три ошибки; 1- бал – не справился с заданием. Результаты сведены в таблицу 1.

Применяем методику «Найди и вычеркни» для дошкольников и младших школьников и анализируем результаты тестирования правильно

Дата: 27 июля 2016 Автор: Наталья Василишин Рубрика: Школа

Внимание — важный показатель интеллектуального развития ребёнка. Существует несколько методик, которые позволяют определить, насколько хорошо может сосредотачиваться малыш на том или ином задании. Однако большинство из них требует интерпретации профессионального психолога. Тест «Найди и вычеркни» удобен тем, что для анализа его результатов достаточно обладать элементарными навыками математических вычислений.

Характеристика методики «Найди и вычеркни» и её авторы

Идея создания методики «Найди и вычеркни» принадлежит Татьяне Давидовне Марцинковской, доктору психологических наук, специалисту в области истории психологии. Приём изначально задумывался как часть диагностической процедуры, определяющей роль переживания в механизме социализации детей 5–6 лет. Позднее Евгений Леонидович Доценко, доктор психологических наук, в рамках исследований психологии взрослеющей личности адаптировал тест для малышей 3–4 лет. Суть диагностики заключается в последовательном и ограниченном по времени вычёркивании заданных фигур, изображённых на листе бумаги. Целями тестирования является следующее:

исследование продуктивности внимания;
определение его устойчивости, объёма и переключаемости.

Существует два варианта методики: для детей 3–4 лет и для тех, кому исполнилось 5–6. В первом случае испытуемому предлагается матрица с ёлочками, звёздочками, цветами, домиками, ведёрками, грибками, флажками и мячами. Во втором — с треугольниками, прямоугольниками, флажками, кружками, звёздочками, полукругами. Для определения показателей внимания у детей младшего школьного возраста и старше используется корректурная проба «Кольца Ландольта».

Диагностика внимания — важное мероприятие, помогающее определить, хорошо ли школьник умеет концентрироваться на заданиях

Процедура проведения теста для дошкольников и младших школьников

Тестирование «Найди и вычеркни» проходит в индивидуальной форме. На выполнение задания ребёнку выделяется 2,5 минуты, в течение которых испытуемому необходимо 5 раз вычеркнуть по 2 предмета на выбор экспериментатора. На работу с одной парой отводится 30 секунд. Каждую фигурку необходимо вычёркивать определённым образом, чтобы организатору было легче подсчитывать результаты: например, домик горизонтальной чертой, а грибок — вертикальной.

Инструкция:

Ребёнок получает лист с картинками.
Взрослый объясняет: «Ты видишь перед собой много знакомых тебе предметов. Мы с ними будем играть, точнее, вычёркивать. Я назову 2 объекта, скажу, каким образом каждый из них отметить, и дам команду «начинай». После этого ты приступишь к работе. Когда услышишь «стоп», тебе нужно будет показать, на какой фигурке ты остановился. А потом мы продолжим, и по команде ты будешь вычёркивать следующую пару фигур. И так до тех пор, пока я не скажу «конец»».
Экспериментатор ставит отметку на бланке каждые 30 секунд.
После завершения работы над заданием испытуемый отдаёт выполненный тест.

Файлы: Материалы к тестированию

Стимульный материал для детей 3–4 и 5–6 лет

Матрица для испытуемых старше 6 лет

Обработка и анализ результатов

Результаты теста нужно обязательно обсудить с родителями испытуемого, чтобы помочь выработать стратегию занятий с малышом

По данным исследований Института психологии при РАН, за последние 5 лет продуктивность и устойчивость внимания детей в возрасте 5–6 лет повысились на 4,5% в сравнении с результатами, полученными 10 лет назад.

В процессе анализа результатов важно определить, сколько предметов малыш вычеркнул за всё время теста, а какое количество за каждые 30 секунд.

Для подсчёта общего уровня развития продуктивности и устойчивости внимания используется формула:

S=(1/2 N — 2,8 n) / t, где S — общее значение показателей внимания, N — сколько фигур ребёнок просмотрел, n — какое количество ошибок испытуемый допустил (то есть неправильно отметил или пропустил фигуру), t — время, потраченное на работу.

По этой формуле рассчитываются 6 показателей:

для всего времени работы над тестом;
для каждого из пяти «подходов».

Следовательно, в качестве показателя t нужно учитывать 150 секунд (весь тест) или 30 (работа с одной парой фигур).

После подсчёта результатов экспериментатор переводит получившееся значение в баллы:

10 баллов, если S = больше 1,25;
8–9 – от 1 до 1,25
6–7 — от 0,75 до 1;
4–5 – от 0,5 до 0,75;
2–3 – от 0,24 до 0,5;
0–1 — от 0 до 0,2.
Сравнить получившуюся кривую необходимо с этим графиком

Затем взрослый составляет график и сравнивает получившуюся кривую с образцом:

10 баллов — все точки построенного графика не выходят за пределы одной зоны, а сама линия напоминает образец кривой 1;
8–9 баллов — все точки располагаются в двух областях значений, напоминающих кривую 2;
6–7 баллов — точки находятся в трёх зонах значений, а сама линия похожа на образец 3;
4–5 баллов — точки графика располагаются в четырёх областях, а кривая напоминает график 4;
3 балла – все точки находятся в пяти зонах, а кривая похожа на график 5.

Для формулировки выводов об устойчивости и продуктивности внимания можно обойтись и без графиков, которые нужны в том случае, если для ребёнка создаётся портфолио психологического развития личности (таковое требуется в некоторых дошкольных учреждениях и школах). Результаты оцениваются так:

10 баллов — очень высокие показатели продуктивности и устойчивости внимания;
8–9 баллов — высокая продуктивность и устойчивость;
4–7 баллов — средние показатели и продуктивности, и устойчивости;
2–3 балла — низкие показатели продуктивности и устойчивости;
0–1 балл — очень низкие показатели продуктивности и устойчивости.

При средних показателях с ребёнком рекомендуется регулярно (2–3 раза в неделю) выполнять упражнения, развивающие внимание. Например, такие как «Запомни и расставь точки» (подробнее об этом можно прочитать в статье «Проводим диагностику внимания ребёнка с помощью методики «Запомни и расставь точки») или «Тест Бурдона» (о нём рассказывается в материале «Как правильно провести тест Бурдона для диагностики внимания младших школьников). В случае низких показателей необходима помощь психолога, который сможет подобрать индивидуальную программу работы с малышом.

Методика «Найди и вычеркни» – удобный и простой способ определить, насколько хорошо ребёнок способен концентрировать внимание, переключать его и усваивать информацию. Данные такого теста особенно пригодятся для определения готовности малыша к дальнейшему обучению в школе.

Высшее филологическое образование, 11 лет стажа преподавания английского и русского языков, любовь к детям и объективный взгляд на современность — ключевые линии моей 31-летней жизни.

Сильные качества: ответственность, желание узнавать новое и самосовершенствоваться. Оцените статью: Поделитесь с друзьями!

Метки:

Диагностика познавательной деятельности дошкольников с ЗПР

Диагностика познавательных процессов дошкольников с ЗПР

Определение 1

Задержка психического развития (ЗПР) – это нарушение нормального темпа психического развития, в результате которого оно соответствует показателям младшего возраста.

Данную проблему рассматривает психодиагностика – направление практической психологии, изучающее особенности применения диагностических методик для определения уровней познавательного, эмоционального, личностного развития ребенка.

У детей с ЗПР отмечается низкий уровень познавательной активности, незрелая мотивация учебной деятельности. Прием и переработка информации у таких детей имеет сниженную способность, они имеют ограниченные представления об окружающем мире, недостаточную сформированность умственных операций, отставание в речевом развитии.

Помощь со студенческой работой на тему

Диагностика познавательной деятельности дошкольников с ЗПР

Диагностическая работа с детьми с задержкой психического развития имеет свою цель, которая заключается в разработке методических рекомендаций на основе анализа выполнения диагностических методик.

Специалисты в этой области Н.Я. Семаго и М.М. Семаго предлагают технологию психологического обследования ребенка с отклоняющимся развитием. Эта технология включает сбор психологического анамнеза и психологическое обследование, интерпретацию результатов и психологическое заключение.

Проходит психологическое обследование поэтапно:

началом обследования является беседа для установления контакта с ребенком, определение информированности ребенка;
исследование восприятия ребенка;
исследование его внимания;
исследование зрительной памяти;
исследование уровня схематического мышления, способности к сравнению, обобщению, классификации;
исследование речевой деятельности, звуковой и смысловой её сторон;
исследование эмоционально-волевой сферы и её особенностей;
общие выводы и психолого-педагогические рекомендации.

Выводы, сделанные на основании этого исследования, заносятся в карту психологического обследования ребенка.

Специалисты считают, что больший эффект психологического обследования ребенка с ЗПР, можно получить в ходе разных видов деятельности, по результатам наблюдения за ними на занятиях, а также в их свободной деятельности.

Методики диагностики дошкольников с ЗПР

Познавательное развитие дошкольников с ЗПР можно диагностировать с помощью тестов: по методике С. Лиепинь – устойчивость, распределение и переключение внимания, по методике Когана – схематическое мышление, логичность мышления – тесты «Обобщение понятий», «Конкретизация понятий», «Классификация», «Сравнение».

Произвольность диагностируется тестом – «Запрещенные слова». Диагностика речевого развития – по методике Эббингауза и ассоциативного эксперимента.

Цель методики С. Лиепинь заключается в изучении устойчивости, распределения и переключения внимания. Для этого ребенку предлагается бланк, на котором изображены три вида знакомых предметов – грибы, мячи, ели, расположенные по восемь в каждом ряду.

Насколько внимание ребенка устойчиво оценивается по выполнению задания, в котором нужно зачеркнуть все мячи. Распределение и переключение внимания оценивается по елям, вычеркнутым красным карандашом, а мячи вычеркиваются синим карандашом. Результат ниже 50% соответствует низкому уровню развития внимания, а это уже может быть свидетельством о наличии у ребенка ЗПР.

Замечание 1

Внимание детей с ЗПР очень неустойчиво, без игровой мотивации они неспособны к его концентрации и длительному напряжению.

Для исследования схематического мышления используется тест Когана. Стимульный материал этого теста представлен таблицами, на которых изображены геометрические фигуры и образцы разного цвета, и отдельные карточки с теми же фигурами и цветом.

Ребенок тестируется в два этапа. Сначала надо разложить карточки по цвету или по форме. Затем разложить карточки так, чтобы каждая попала в свою клеточку. Если результат задания выполнен ниже 50% , то это соответствует низкому уровню развития схематического мышления и является свидетельством наличия у ребенка ЗПР.

Дети с ЗПР не способны к целостному восприятию и испытывают затруднения с классификацией фигур. Цель классификации – исследовать логичность мышления. Стимульный материал состоит из 16 карточек, на которых изображены животные, мебель, фрукты, овощи. Задача ребенка – разложить карточки на четыре группы. Картинки каждой группы должны подходить друг к другу, чтобы их можно было бы назвать «одним словом». Низкий уровень развития логичности мышления будет ниже 50% от выполненного задания, а это говорит о наличии ЗПР. Объяснить свои действия и ответы дети с ЗПР не могут.

Тест «Сравнение» тоже применяется для исследования логичности мышления. Стимульный материал представляют пять пар слов, которые ребенку надо сравнить и назвать их похожесть и различие. Слова следующие: бабочки-ласточки, яблони-березы, лисы-собаки, цветы-деревья, рыбы-птицы. Результат ниже 50% свидетельствует о наличии ЗПР, потому что соответствует низкому уровню развития логичности мышления.

Тест «Запрещенные слова» применяется для того, чтобы оценить сформированность произвольности и уровень развития речи. Ребенку предлагается игра, в которой он должен ответить на задаваемые вопросы. В игре есть условие, не произносить слова «да» и «нет», а также нельзя называть цвет. Здесь тоже результат выполнения задания ниже 50% говорит о низком уровне произвольности и является свидетельством наличия ЗПР.

Элемент произвольности у большинства детей проявляется слабо, словарный запас небольшой, они не умеют соотносить свои действия с правилами и используют для ответов слова из вопросов. Например, вода мокрая? – мокрая, летом трава какая? – летняя, снег черный? – черный.

Целью теста «Обобщение понятий» является исследование логичности мышления, а в стимульном материале находится набор близких понятий. Дети получают задание на обобщение – десять рядов конкретных понятий назвать одним словом, например:

шкафы, кровати, стулья;
куртки, футболки, брюки;
вороны, голуби, утки;
смородина, клубника, малина;
моряки, летчики, артиллеристы и др.

Низкому уровню развития логичности мышления будет соответствовать результат ниже 50%, что может свидетельствовать о наличии у ребенка ЗПР.

Классификация ЗПР у дошкольников

Для того чтобы систематизировать нарушения в организме человека, применяют классификацию детского дефектолога и психиатра К.С. Лебединской.

Задержку психического развития у детей она делит на 4 вида:

соматогенную,
конституционную,
церебрально-органическую,
психогенную.

Соматогенная форма нарушений может быть вызвана чрезмерной опекой родителей, которые не дают ребенку проявить самостоятельность и вторая причина – это длительные и частые болезни ребенка, замедляющие развитие психики.

Второй вид ЗПР – конституционный, обусловленный наследственностью. Конституционная форма проявляется недоразвитием эмоционально-волевого фона и без помощи взрослых ребенок не может принять самостоятельных решений. Эмоции ребенка бурные и быстро сменяющиеся. Ребенок с данной формой нарушений особого стремления к школьному познанию и обучению не проявляет и предпочитает игровую деятельность.

Что касается церебрально-органической формы ЗПР, то она является наиболее распространенной, а её прогноз негативный. Нарушения в этом случае вызваны органическими поражениями центральной нервной системы ребенка. Причины этих поражений могут быть связаны с патологией вынашивания, родовыми травмами, недоношенностью ребенка, нейроинфекциями. У детей отмечается присутствие ММД – это минимальная мозговая дисфункция. Такой ребенок, как правило, имеет бедное воображение с отсутствием эмоциональности.

Психогенный вид ЗПР связан с социальным неблагополучием семьи – домашняя агрессия или насилие, отсутствие всякого воспитания и ребенок предоставлен сам себе. Уровень знаний об окружающем мире у таких детей находится на очень низком уровне. Дети могут быть обучаемы с помощью педагогов.

Общая информация о центре

Государственное учреждение образования

«Гродненский районный социально-педагогический центр»

Директор центра: Пик Татьяна Николаевна, тел. 8 (0152) 68-57-74. В должности с 21.08.2003 года.

Дата создания и реорганизации центра: Учреждение образования «Лойковский государственный детский социальный приют» был открыт 06. 10.2003 года на основании Решения Гродненского районного исполнительного комитета №455 от 26.06.2003г. «Об открытии на базе Лойковского детского сада двух групп типа «детский социальный приют» и передаче на содержание отделу образования Гродненского районного исполнительного комитета Лойковского детского сада». 28.01.2008 года приют реорганизован на основании Решения Гродненского районного исполнительного комитета №63 от 28.01.2008 г. «О переименовании Учреждение образования «Лойковский государственный детский социальный приют» в Государственное учреждение образования «Гродненский районный социально-педагогический центр».

Основными задачами Центра в соответствии с Положением о социально-педагогическом учреждении, утвержденным Постановлением Министерства образования Республики Беларусь от 27 ноября 2017 г. № 145, а также Уставом Гродненского районного СПЦ, являются:

— обеспечение прав детей на получение своевременной квалифицированной социально-педагогической, психологической и иной помощи со стороны государства;

— реализация программы воспитания и защиты прав и законных интересов детей, находящихся в социально опасном положении;

— содействие органам опеки и попечительства в жизнеустройстве несовершеннолетних, детей-сирот, детей, оставшихся без попечения родителей;

— обеспечение охраны жизни и укрепления здоровья воспитанников;

— оказание правовой помощи несовершеннолетним и их законным представителям;

— обеспечение реализации мероприятий комплексной реабилитации несовершеннолетних, потребление которыми наркотических средств, психотропных веществ, их аналогов, токсических или других одурманивающих веществ, употребление алкогольных, слабоалкогольных напитков или пива установлены в соответствии с законодательством Республики Беларусь;

— оказание социально-педагогической и психологической помощи несовершеннолетним и их законным представителям.

Основные направления деятельности центра:

координация деятельности учреждений образования в пределах административно-территориальной единицы, за исключением учреждений образования, подчиненных областным исполнительным комитетам, Минскому городскому исполнительному комитету, отраслевым министерствам, по выявлению и учету детей, находящихся в социально опасном положении, их социально-педагогической реабилитации и оказанию им психологической помощи;
консультирование педагогических работников учреждений образования, указанных в подпункте 11.1 настоящего пункта, по вопросам:
оказания психологической и педагогической помощи и социально-педагогической поддержки семьям, принявшим на воспитание детей-сирот и детей, оставшихся без попечения родителей;
создания необходимых условий для получения образования воспитанниками опекунских и приемных семей, детских домов семейного типа и подготовки воспитанников к самостоятельной жизни;
реализации мероприятий комплексной реабилитации несовершеннолетних, потребление которыми наркотических средств, психотропных веществ, их аналогов, токсических или других одурманивающих веществ, употребление алкогольных, слабоалкогольных напитков или пива установлены в соответствии с законодательством Республики Беларусь;
реализация программы воспитания и защиты прав и законных интересов детей, находящихся в социально опасном положении;
признание несовершеннолетних находящимися в социально опасном положении и организация работы по оказанию им социально-педагогической и психологической помощи;
предоставление приемным семьям, а по поручению органов опеки и попечительства и детским домам семейного типа психологической и педагогической помощи и социально-педагогической поддержки;
обеспечение реализации мероприятий комплексной реабилитации несовершеннолетних, потребление которыми наркотических средств, психотропных веществ, их аналогов, токсических или других одурманивающих веществ, употребление алкогольных, слабоалкогольных напитков или пива установлены в соответствии с законодательством Республики Беларусь;
осуществление мер социальной защиты и реабилитации в отношении детей – жертв торговли людьми;
создание условий для временного проживания (не более шести месяцев) и осуществление социальной реабилитации детей в возрасте от трех до восемнадцати лет, указанных в пункте 21 настоящего Положения, до их возвращения в семью или определения их дальнейшего жизнеустройства;
осуществление социального патроната семей в случаях принятия решения комиссией по делам несовершеннолетних районного (городского) исполнительного комитета, местной администрации района в городе (далее – КДН) о возвращении ребенка родителям (единственному родителю) в целях восстановления способности семьи к выполнению обязанностей по воспитанию, обучению и содержанию ребенка, защите прав и законных интересов ребенка;
ведение учета данных о детях, признанных находящимися в социально опасном положении;
осуществление информационно-аналитической деятельности по вопросам профилактики семейного неблагополучия, социального сиротства на территории соответствующей административно-территориальной единицы;
оказание психологической помощи, в том числе проведение психологической диагностики, детям и их законным представителям с целью выяснения сложившихся детско-родительских отношений между каждым из родителей и детьми;
организация психологического обследования кандидатов в усыновители, приемные родители и родители-воспитатели и их обучение;
иные функции, предусмотренные законодательством Республики Беларусь и уставом СПЦ.

В центре функционируют:

совет центра;
педагогический совет;
семейный совет;
методическое объединение воспитателей;
медико-психологичекий консилиум;
информационная группа;
методическое объединение приемных родителей, родителей-воспитателей;
совет по профилактике безнадзорности и правонарушений несовершеннолетних;
«Телефон доверия» — 68-15-14
Мобильная антикризисная группа

СПЦ взаимодействует со следующими организациями:

Управлением образования Гродненского райисполкома;
ОВД Гродненского райисполкома, ИДН ОВД Гродненского райисполкома, КДН, ТЦСОН, судами;
Учреждениями здравоохранения;
Учреждениями образования;
Скидельским городским исполнительным комитетом и сельским исполнительным комитетом Гродненского района;
СПК Гродненского района, ОО «БРСМ», профсоюзными организациями;
Старостами деревень Гродненского района, а также с частными предприятиями и организациями, гражданами Гродненского района, г. Гродно.

Видео о деятельности Гродненского СПЦ:

Наши адреса:

Информационно-правовая служба: 230005, г. Гродно, ул. Господарчая, 10.

Контактный телефон: 8 (0152) 55-71-37.

Режим работы: с 8.00 до 17.00, обед с 13.00 до 14.00.

Электронный адрес: [email protected]

Детский социальный приют: (работает круглосуточно) 231737, Гродненский район, агр. Лойки, ул. Центральная, 211.

Контактные телефоны: 8 (0152) 68-57-74, 8 (0152) 68-20-91.

Электронный адрес: [email protected]

Методика «Чего не хватает на этих рисунках?»

ВНИМАНИЕ

Методика «Чего не хватает на этих рисунках?»

Суть этой методики состоит в том, что ребенку предлагается серия рисунков, представленных на рис 1. На каждой из картинок этой серии не хватает какой-то существенной детали Ребенок получает задание как можно быстрее определить и назвать отсутствующую деталь.

Проводящий психодиагностику с помощью секундомера фиксирует время, затраченное ребенком на выполнение всего задания Время работы, оценивается в баллах, которые затем служат основой для заключения об уровне развития восприятия ребенка

Оценка результатов

10 баллов– ребенок справился с заданием за время меньшее, чем 25 сек, назвав при этом все 7 недостающих на картинках предметов

8-9 баллов– время поиска ребенком всех недостающих предметов заняло от 26 до 30 сек

6-7 баллов– время поиска всех недостающих предметов заняло от 31 до 35 сек

4-5 баллов– время поиска всех недостающих предметов составило от 36 до 40 сек

2-3 балла– время поиска всех недостающих предметов оказалось в пределах от 41 до 45 сек

0-1 балл– время поиска всех недостающих деталей составило в целом больше чем 45 сек

Выводы об уровне развития

10 баллов – очень высокий.

8-9 баллов – высокий

4-7 баллов – средний

2-3 балла – низкий

0-1 балл – очень низкий.

Методика «Запомни и расставь точки»

С помощью данной методики оценивается объем внимания ребенка. Для этого используется стимульный материал, изображенный на рис. 9 Лист с точками предварительно разрезается на 8 малых квадратов, которые затем складываются в стопку таким образом, чтобы вверху оказался квадрат с двумя точками, а внизу – квадрат с девятью точками (все остальные идут сверху вниз по порядку с последовательно увеличивающимся на них числом точек).

Перед началом эксперимента ребенок получает следующую инструкцию:

«Сейчас мы поиграем с тобой в игру на внимание. Я буду тебе одну за другой показывать карточки, на которых нарисованы точки, а потом ты сам будешь рисовать эти точки в пустых клеточках в тех местах, где ты видел эти точки на карточках».

Далее ребенку последовательно, на 1-2 сек, показывается каждая из восьми карточек с точками сверху вниз в стопке по очереди и после каждой очередной карточки предлагается воспроизвести увиденные точки в пустой карточке (рис. 10) за 15 сек. Это время дается ребенку для того, чтобы он смог вспомнить, где находились увиденные точки, и отметить их в пустой карточке.

Оценка результатов

Объемом внимания ребенка считается максимальное число точек, которое ребенок смог правильно воспроизвести на любой из карточек (выбирается та из карточек, на которой было воспроизведено безошибочно самое большое количество точек). Результаты эксперимента оцениваются в баллах следующим образом:

10 баллов– ребенок правильно за отведенное время воспроизвел на карточке 6 и более точек

8-9 баллов– ребенок безошибочно воспроизвел на карточке от 4 до 5 точек

6-7 баллов– ребенок правильно восстановил по памяти от 3 до 4 точек.

4-5 баллов– ребенок правильно воспроизвел от 2 до 3 точек.

0-3 балла– ребенок смог правильно воспроизвести на одной карточке не более одной точки.

Методика «Найди и вычеркни»

Задание, содержащееся в этой методике, предназначено для определения продуктивности и устойчивости внимания. Ребенку показывают рис. 5. На нем в случайном порядке даны изображения простых фигур: грибок, домик, ведерко, мяч, цветок, флажок. Ребенок перед началом исследования получает инструкцию следующего содержания:

Сейчас мы с тобой поиграем в такую игру: я покажу тебе картинку, на которой нарисовано много разных, знакомых тебе предметов. Когда я скажу слово «начинай», ты по строчкам этого рисунка начнешь искать и зачеркивать те предметы, которые я назову. Искать и зачеркивать названные предметы необходимо до тех пор, пока я не скажу слово «стоп». В это время ты должен остановиться и показать мне то изображение предмета, которое ты увидел последним. После этого я отмечу на твоем рисунке место, где ты остановился, и снова скажу слово «начинай». После этого ты продолжишь делать то же самое, т.е. искать и вычеркивать из рисунка заданные предметы. Так будет несколько раз, пока я не скажу слово «конец». На этом выполнение задания завершится».

В этой методике ребенок работает 2,5 мин, в течение которых пять раз подряд (через каждые 30 сек) ему говорят слова «стоп» и «начинай».

Экспериментатор в этой методике дает ребенку задание искать и разными способами зачеркивать какие-либо два разных предмета, например, звездочку перечеркивать вертикальной линией, а домик – горизонтальной. Экспериментатор сам отмечает на рисунке ребенка те места, где даются соответствующие команды.

Обработка и оценка результатов при обработке и оценке результатов определяется количество предметов на рисунке, просмотренных ребенком в течение 2,5 мин, т.е. за все время выполнения задания, а также отдельно за каждый 30-секундный интервал. Полученные данные вносятся в формулу, по которой определяется общий показатель уровня развитости у ребенка одновременно двух свойств внимания: продуктивности и устойчивости:

где S – показатель продуктивности и устойчивости внимания обследованного ребенка;

N– количество изображений предметов на рис. 5 (6), просмотренных ребенком за время работы;

t – время работы;

n – количество ошибок, допущенных за время работы. Ошибками считаются пропущенные нужные или зачеркнутые ненужные изображения.

В итоге количественной обработки психодиагностических данных определяются по приведенной выше формуле шесть показателей, один – для всего времени работы над методикой (2,5 мин), а остальные – для каждого 30-секундного интервала. Соответственно, переменная t в методике будет принимать значение 150 и 30.

По всем показателям S, полученным в процессе выполнения задания, строится график следующего вида (рис. 8), на основе анализа которого можно судить о динамике изменения во времени продуктивности и устойчивости внимания ребенка. При построении графика показатели продуктивности и устойчивости переводятся (каждый в отдельности) в баллы по десятибалльной системе следующим образом:

10 баллов– показатель S у ребенка выше, чем 1,25 балла.

8-9 баллов– показатель S находится в пределах от 1,00 до 1,25 балла

6-7 баллов– показатель S находится в интервале от 0,75 до 1,00 балла

4-5 баллов– показатель S находится в границах от 0,50 до 0,75 балла.

2-3 балла– показатель S находится в пределах от 0,24 до 0,50 балла.

0-1 балл– показатель S находится в интервале от 0,00 до 0,2 балла.

Методика С. Лиепинь

Цель — изучение устойчивости, распределения и переключения внимания.

Для оценки устойчивости внимания дается задание зачеркнуть все мячи.

Для оценки распределения и переключения внимания надо вычеркнуть ели красным карандашом, а мячи — синим.

ПАМЯТЬ

Методика «Узнай, кто это»

Прежде чем применять эту методику, ребенку объясняют, что ему будут показаны части, фрагменты некоторого рисунка, по которым необходимо будет определить то целое, к которому эти части относятся, т е по части или фрагменту восстановить целый рисунок

Психодиагностическое обследование при помощи данной методики проводится следующим образом Ребенку показывают рис 2, на котором листком бумаги прикрыты все фрагменты, за исключением фрагмента «а» Ребенку предлагается по данному фрагменту сказать, какому общему рисунку принадлежит изображенная деталь На решение данной задачи отводится 10 сек Если за это время ребенок не сумел правильно ответить на поставленный вопрос, то на такое же время – 10 сек – ему показывают следующий, чуть более полный рисунок «б», и так далее до тех пор, пока ребенок, наконец, не догадается, что изображено на этом рисунке

Учитывается время, в целом затраченное ребенком на решение задачи, и количество фрагментов рисунка, которые ему пришлось просмотреть прежде, чем принять окончательное решение

Оценка результатов

10 баллов– ребенок по фрагменту изображения «а» за время меньшее чем 10 сек, сумел правильно определить, что на целом рисунке изображена собака

7-9 баллов– ребенок установил, что на данном рисунке изображена собака, только по фрагменту изображения «б», затратив на это в целом от 11 до 20 сек

4-6 баллов– ребенок определил, что это собака, только по фрагменту «в», затратив на решение задачи от 21 до 30 сек

2-3 балла– ребенок догадался, что это собака, лишь по фрагменту «г», затратив от 30 до 40 сек

0-1 балл– ребенок за время, большее чем 50 сек, вообще не смог догадаться, что это за животное, просмотрев все три фрагмента «а», «б» и «в»

Оценка результатов

10 баллов– ребенок справился с заданием меньше чем за 20 сек

8-9 баллов– ребенок решил правильно все четыре задачи за время от 21 до 30 сек.

6-7 баллов– ребенок затратил на выполнение задания от 31 до 40 сек.

4-5 баллов– ребенок израсходовал на выполнение задания от 41 до 50 сек.

2-3 балла– время работы ребенка над заданием заняло от 51 до 60 сек.

0-1 балл– ребенок не справился с выполнением задания за время свыше 60 сек.

МЫШЛЕНИЕ

1. Цель данной методики – оценка образно-логического мышления ребенка. Рассчитан на детей в возрасте от 4 до 5 лет.

Ребенку показывают картинку, изображенную на рис 1, и предлагают следующее задание: «Внимательно посмотри на картинку и раздели представленные на ней фигуры на как можно большее число групп. В каждую такую группу должны входить фигуры, выделяемые по одному общему для них признаку. Назови все фигуры, входящие в каждую из выделенных групп, и тот признак, по которому они выделены»

На выполнение всего задания отводится 3 мин.

Выводы об уровне развития

Замечание

Одна и та же фигура при классификации может войти в несколько разных групп

10 баллов

Ребенок выделил все группы фигур за время меньшее, чем 2 мин. Эти группы фигур следующие: треугольники, круги, квадраты, ромбы, красные фигуры (на рис. они черного цвета), синие фигуры (заштрихованы в линейку), желтые фигуры (в клеточку), большие фигуры, малые фигуры.

Очень высокий

8-9 баллов Ребенок выделил все группы фигур за время от 2,0 до 2,5 мин.

Высокий

6-7 баллов ребенок выделил все группы фигур за время от 2,5 до 3,0 мин.

Средний

4-5 баллов За время 3 мин ребенок сумел назвать только от 5 до 7 групп фигур.

2-3 балла За время 3 мин ребенок сумел выделить только от 2 до 3 групп фигур.

Низкий

0-1 балла За время 3 мин ребенок сумел выделить не более одной группы фигур

Выводы об уровне развития

20-18 вопросов- ребенок готов к школе

17-14- средняя готовность

14-13-необходимы дополнительные обследования

От13 и ниже-подготовка ниже нормы.

Выводы об уровне развития

Замечание

Одна и та же фигура при классификации может войти в несколько разных групп.

Очень высокий

10 баллов — Ребенок решил поставленную перед ним задачу за время меньшее, чем 1 минута, назвав лишние предметы на всех картинках и правильно объяснив, почему они являются лишними.

Высокий

8-9 баллов- Ребенок правильно решил задачу за время от 1 до 1,5 минут.

Средний

6-7 баллов- Ребенок справился с задачей за время от 1,5 до 2 минут.

4-5 баллов- Ребенок решил задачу за время от 2 до 2,5 минут.

Низкий

2-3 балла- Ребенок решил задачу за время от 2,5 до 3 минут.

Очень низкий

0-1 балл- Ребенок за 3 минуты не справился с заданием.

4. Цель: исследование развития логического мышления, речи, способности к обобщению.

Стимульный материал: серии сюжетных картин (3-6) с изображением последовательности событий 2 варианта:

а) картинки с явным смыслом сюжета – по деталям изображения можно восстановить причинно-следственные и временные отношения;

б) картинки со скрытым смыслом сюжета – когда требуется привлечь определенные знания о закономерностях явлений природы и окружающей действительности.

Процедура проведения методики: перед ребенком кладут произвольно картинки, связанные сюжетом. Ребенок должен понять сюжет, выстроить правильную последовательность событий и составить по картинке рассказ. Задание состоит из двух частей:

1)выкладывание последовательности событий картинок;

2) устный рассказ по ним.

После того, как ребенок разложил все картинки, экспериментатор записывает в протоколе (например, 5, 4, 1, 2, 3), и затем просит ребенка рассказать по порядку о том, что получилось. Если ребенок допустил ошибки, ему задают вопросы, цель которых помочь выявить допущенные ошибки.

Инструкция: «Посмотри, перед тобой лежат картинки, на которых нарисовано какое-то событие. Порядок картин перепутан, и тебе надо догадаться, как их поменять местами, чтобы стало ясно, что нарисовал художник. Подумай, переложи картинки, как ты считаешь нужным, а потом составь по ним рассказ о том событии, которое здесь изображено».

Выводы об уровне развития

Высокий

Ребенок самостоятельно нашел последовательность картинок и составил логический рассказ. При неправильно найденной последовательности рисунков испытуемый тем не менее сочиняет логичную версию рассказа.

Средний

Ребенок правильно нашел последовательность, но не смог составить хорошего рассказа. Составление рассказа с помощью наводящих вопросов экспериментатора.

Низкий

Ребенок не смог найти последовательность картинок и отказался от рассказа; по найденной им самим последовательности картинок составил нелогичный рассказ; составленная ребенком последовательность не соответствует рассказу; каждая картинка рассказывается отдельно, сама по себе, не связана с остальными – в результате не получается рассказа; на каждом рисунке просто перечисляются отдельные предметы.

Методика «Нелепицы»

Цель: оценка образно-логического мышления ребенка. При помощи этой методики оцениваются элементарные образные представления ребенка об окружающем мире, о логических связях и отношениях, существующих между некоторыми объектами этого мира: животными, их образом жизни, природой. С помощью этой же методики определяется умение ребенка рассуждать логически и грамматически правильно выражать свою мысль.

Стимульный материал: картинки с нелепым содержанием 2 варианта:

а) бытовые ситуации;

б) природные явления.

Процедура проведения: вначале ребенку показывают первую картинку, в ней имеется несколько довольно нелепых ситуаций на бытовую тему. Во время рассматривания картинки ребенок получает инструкцию примерно следующего содержания: «Внимательно посмотри на эту картинку и скажи, все ли здесь находится на своем месте и правильно нарисовано. Если что-то тебе покажется не так, не на месте или неправильно нарисовано, то укажи на это и объясни, почему это не так. Далее ты должен будешь сказать, как на самом деле должно быть».

Примечание. Обе части инструкции нелепицы выполняются последовательно. Сначала ребенок просто называет все нелепицы и указывает их на картинке, а затем объясняет, как на самом деле должно быть. Время экспозиции картинок и выполнения задания ограничено 3 минутами. За это время ребенок должен заметить, как можно больше нелепых ситуаций и объяснить, что не так, почему не так и, как на самом деле должно быть.

Выводы об уровне развития

Очень высокий

10 баллов-Такая оценка ставится ребенку в том случае, если за отведенное время он заметил все имеющиеся на картинке нелепицы, успел удовлетворительно объяснить, что не так, и, кроме того, сказать, как на самом деле должно быть.

Высокий

8-9 баллов- Ребенок заметил и отметил все имеющиеся нелепицы, но от одной до трех из них не сумел до конца объяснить или сказать, как на самом деле должно быть.

Средний

6-7 баллов- Ребенок заметил и отметил все имеющиеся нелепицы, но 3-4 из них не успел до конца объяснить и сказать, как на самом деле должно быть.

4-5 баллов- Ребенок заметил все имеющиеся нелепицы, но 5-7 из них не успел за отведенное время до конца объяснить и сказать, как на самом деле должно быть.

Низкий

2-3 балла- За отведенное время ребенок не успел заметить 1-4 из 7 нелепиц, а до объяснения дело не дошло.

Очень низкий

0-1 балл- За отведенное время ребенок успел обнаружить меньше четырех из 7 имеющихся нелепиц.

ВНИМАНИЕ

Методика «Чего не хватает на этих рисунках?»

Оценка результатов

8-9 баллов– время поиска ребенком всех недостающих предметов заняло от 26 до 30 сек

6-7 баллов– время поиска всех недостающих предметов заняло от 31 до 35 сек

4-5 баллов– время поиска всех недостающих предметов составило от 36 до 40 сек

2-3 балла– время поиска всех недостающих предметов оказалось в пределах от 41 до 45 сек

0-1 балл– время поиска всех недостающих деталей составило в целом больше чем 45 сек

Выводы об уровне развития

10 баллов – очень высокий.

8-9 баллов – высокий

4-7 баллов – средний

2-3 балла – низкий

0-1 балл – очень низкий.

Изучение внимания у детей с ограниченными возможностями здоровья Текст научной статьи по специальности «Психологические науки»

ИЗУЧЕНИЕ, ОБУЧЕНИЕ И ВОСПИТАНИЕ ДЕТЕЙ С НАРУШЕНИЯМИ РАЗВИТИЯ

УДК 376.2: 159.952 ББКЮ972-515+ 4450

ГСНТП 14.29.01 А. Я. Абкович A. Y. Abkovich

Россия, Москва Russia, Moscow

Код ВАК 13.00.03

ИЗУЧЕНИЕ ВНИМАНИЯ У ДЕТЕЙ С ОГРАНИЧЕННЫМИ ВОЗМОЖНОСТЯМИ ЗДОРОВЬЯ

Аннотация. Рассматриваются вопросы диагностики внимания у детей с ограниченными возможностями здоровья (ОВЗ), описан и проанализирован диагностический инструментарий, который используется в работе психологов в России и в немецкоязычной Европе. Отмечается необходимость изучения внимания у детей с ОВЗ для решения практических задач их обучения и воспитания.

Ключевые слова: внимание; концентрация; дети с ограниченными возможностями здоровья; методики для изучения внимания; тесты.

Сведения об авторе: Абкович Алла Яковлевна, аспирант кафедры специальной педагогики и специальной психологии дефектологического факультета Московского государственного гуманитарного университета им. М. А. Шолохова.

Место работы: государственное автономное учреждение «Московский научно-практический центр реабилитации инвалидов вследствие ДЦП», заведующий отделением дефектологии и психологической коррекции, г. Москва.

Контактная информация: 109390,

E-mail: ab к о v i с ha (а \ a ndc \. ru.

A STUDY OF ATTENTION IN CHILDREN WITH LIMITED HEALTH ABILITIES

Abstract. The article is devoted to the issues of diagnostic assessment of attention in children with limited health abilities (LHA) and the diagnostic techniques used in Russia and German- speaking Europe are described and analyzed. The article highlights the necessity of studying the specific features of attention in children with LHA in order to solve practical tasks of their education and care.

Key words: attention, concentration, children with limited health abilities, methods of studying attention, tests.

About the Author: Abkovich Alia Yakovlevna, Post-graduate Student of Department of Special Education and Special Psychology, Faculty of Defectology of Moscow State Humanitarian University named after M. A. Sholokhov.

Place of employment: State Autonomous Establishment «Moscow Research-Practical Centre for Rehabilitation of Disabled People with Cerebral Palsy», Head of Unit of Defectology and Psychological Correction, Moscow.

г. Москва, ул. 1-я Текстильщиков, д. 6а.

Внимание — это один из важнейших психических процессов, который определяет успех любой человеческой деятельности. Без

©Абкович А. Я., 2014

внимания как умения сосредоточиться на чем-то главном жизнь практически невозможна. Недостатки внимания крайне негативно

Специальное образование. 2014. № 4

сказываются на учебной деятельности детей и затрудняют овладение новыми знаниями.

Недостаточность функций внимания характерна в той или иной мере для всех типов психического дизонтогенеза. Проблемы с вниманием встречаются у детей разных категорий и носят самый разнообразный характер: неустойчивость, трудности распределения и переключения, сужение объема, быстрая истощаемость, слабость произвольного внимания и т. д. Трудности произвольного внимания (от-влекаемость, низкая концентрация, плохое распределение и импульсивность) неизменно встречаются в описаниях разных категорий детей с нарушениями развития (В. И. Лу-бовский) [4]. У. В. Ульенкова связывает внимание с саморегуляцией, расценивая его как показатель общей способности к учению [9]. В то же время целенаправленных всесторонних исследований внимания и его свойств у школьников с ограниченными возможностями здоровья проведено недостаточно. А те немногие исследования, которые существуют, посвящены, в большинстве своем, изучению проблем внимания у учеников с умственной отсталостью или с задержкой психического развития. (И. Л. Баскакова, И. Ф. Марковская, У. В. Ульенкова, С. В. Лиепинь, Л. Ф. Чуп-ров и др.).

Это определяется в значительной степени трудностью выбора диагностического инструментария. Не существует тестов, выполнение которых требовало бы только вни-

мания и концентрации. Внимание не существует в чистом виде, нельзя быть просто внимательным или сконцентрированным, функционально внимание всегда на что-то направлено, а концентрация относится к какой-то определенной деятельности. Поэтому результат теста всегда зависит от вида предлагаемого задания и необходимых для его выполнения навыков. В связи с этим в большинстве тестов на внимание используются самые простые задания, которые не требуют специальных навыков. Использование простых заданий в тесте приводит к тому, что существенное влияние на результат оказывает скорость выполнения и натренированность [11].

Вышеизложенные факты определили проблемное поле нашего исследования: изучение и формирование внимания у детей с ограниченными возможностями здоровья. С целью разработки диагностического комплекса мы обратились к немецкоязычной литературе по проблеме исследования.

Тесты на изучение внимания и способности к концентрации объединяются под единым понятием «общие тесты на работоспособность». В немецких исследованиях по общей психологии и нейропсихологии внимание рассматривается как некий конструкт, близкий к восприятию и тесно связанный с отбором информации. Отсюда вытекают как прагматические характеристики внимания (селективное, фокусируемое, направленное, разделенное, длительное внимание,

Специальное образование. 2014. № 4

вигильность), так и нейропсихоло-гические (бдительность, отбор раздражителей, ориентировка). Концентрация же понимается как быстрая и точная работа в условиях, осложняющих умственную деятельность. Тесты на внимание и концентрацию в большинстве случаев представляют собой относительно простые задания [11].

Обращает на себя внимание дискуссия о том, являются ли концентрация и внимание неким общим конструктом, или это разные

понятия. Большинство немецкоязычных авторов указывают на существенную разницу между понятиями «внимание» и «концентрация», которая состоит в том, что внимание относится к процессу восприятия и служит только для выбора раздражителей или информации, в то время как концентрация касается всех форм переработки информации независимо от стадии. Данный подход проиллюстрирован на рис.

Рис. Внимание и концентрация как независимые понятия. Внимание влияет исключительно на восприятие, концентрация непосредственно влияет на переработку выделенного стимула, но может касаться и восприятия («концентрированное внимание») [11]

Нельзя также не заметить, что общепринятые в России методики исследования внимания, такие как методика Мюнстерберга и другие, в ведущих направлениях исследований внимания за рубежом, как правило, не применяются, а распространенные за рубежом практически никогда (в реальной деятельно-

сти специалистов) не используются в России. Последнее связано также и с отсутствием валидизации зарубежного инструментария.

Большую часть стандартизированных тестовых методик, упоминаемых в немецкоязычной литературе, можно разделить на четыре группы.

Специальное образование. 2014. № 4

Таблица

Категория Общий принцип Пример Исследуемые компоненты внимания

Тесты на вычеркивание Определяется, как хорошо и быстро могут выделяться (вычеркиваться) определенные стимульные раздражители. Измеряется количество обработанного материала (темп работы) и точность (количество ошибок). Наряду с избирательностью внимания, в этих тестах на результат оказывают влияние исто-щаемость внимания (удержание стимула) и способность к зрительному выделению Тест на внимание (d2), Брикенкамп (1962). Возрастные нормы: 9-60 лет Избирательность внимания, устойчивость внимания

Тесты на сортировку Необходимо отыскивать стандартный раздражитель среди различных визуально похожих вариантов ответов Дифференцированный тест на работоспособность (DL-KE und DL-KG), Клебер и Клебер (1974) или Клебер, Клебер и Ханс (1975) Возрастные нормы: 5 лет 7 мес. — 6 лет 6 мес. и соотв. 6 лет 6 мес. — 10 лет 5 мес. Избирательность внимания, устойчивость внимания

Дортмундский тест на внимание (DAT), Лаух (2003). Возрастные нормы: 7—19 лет Устойчивость внимания, избирательность внимания (рефлексив-ность и стратегии)

Задания, связанные со счетными операциями Должны быть произведены или проверены на правильность простые счетные операции. На результат также оказывает влияние оперативная память. Тест на концентрацию (KLT-R) Дюкера и Линер-та (2001). Altersnormen: 4. -6. bzw. 6—13. Klasse Устойчивость внимания (оперативная память, навыки счета)

Батарея тестов для проверки внимания (ТАР), Циммерманн и Фимм (2002). Возрастные нормы: 6—89 лет Все свойства внимания

Компьютеризированные методики Наряду с параллельными версиями бланковых методик для ПК появляются новые адаптивные компьютерные методики, в которых предлагаются динамические стимулы, при этом время обработки сразу учитывается компьютерной программой Батарея тестов для проверки внимания для детей (kiTAP). Циммерманн, Гондан & Фимм (2002). Возратсные нормы на 6—10 лет Все свойства внимания

Специальное образование. 2014. № 4

На современном этапе неотъемлемым элементом в диагностической деятельности психолога стал компьютер. В Европе широко распространены компьютеризированные тесты (модифицированные для использования на компьютере традиционные бланковые методики) и собственно компьютерные тесты (изначально конструируемые с учетом использования компьютерной техники). Чаще всего это задания, которые требуют выбора заданного стимула из череды похожих, например четыре точки в строках с группами из трех или пяти точек или обнаружения цифры «4» среди других цифр, которые последовательно показываются на мониторе. Эти тесты оценивают в первую очередь концентрацию внимания и редко напоминают действия из повседневной жизни, многие из них требуют большей концентрации внимания, нежели в обычной жизни.

В отечественной психодиагностической практике наиболее часто для обследования детей применяются методика Пьерона — Рузера, корректурные пробы (модификации для детей разного возраста), счет по Е. Крепелину (модификация Р. Шульте), методика В. М. Когана, которые позволяют, помимо качественного анализа, получить и некоторые количественные результаты [5; 8]. Последнее в определенном смысле приближает их к психометрическим методикам (тестам).

На основании изученных данных мы составили перечень диагностических методик, наиболее

часто используемых для психологического изучения свойств внимания в детском возрасте. Таким образом был сконструирован диагностический комплекс, состоящий из традиционных методик, в который вошли методика «Отыскивание чисел», методика «Красно-черная таблица» Ф. Д. Горбова, «Корректурная проба» (тест Бурдона) [1; 5; 8].

С целью расширения возможностей диагностики и увеличения арсенала психодиагностического инструментария мы включили в диагностический комплекс широко распространенную за рубежом методику «Тест на внимание» <¿2 Рольфа Брикенкампа и Эрика Цил-мера (последняя версия относится к 2002 г.). Тест <¿2 представляет собой модификацию так называемых тестов на вычеркивание (аналогичны буквенному варианту корректурной пробы Бурдона, но не требуют знания алфавита). Измерение темпа и точности выполнения задания при различении похожих визуальных раздражителей дает возможность оценить индивидуальные характеристики внимания. Объективность, надежность, достоверность теста, простота применения и небольшие временные и материальные затраты при проведении диагностики являются причиной того, что тест <¿2 относится к наиболее распространенным в Германии. Он широко используется и в других европейских странах.

В тесте используется всего три стимула: «р», «с1» и «’», количество знаков, анализируемых испытуемым, доведено до 18. Бланк состоит

Специальное образование. 2014. № 4

из 14 строк по 47 стимулов в каждой строке. Нечетные строки состоят из знаков «’» «,» «»» и пропусков, а четные — из «р» и «с1». Испытуемому необходимо вычеркнуть «с1» с двумя штрихами. На каждую строку дается 20 секунд. Чистое время проведения теста — 4 мин 40 с, общее время тестирования с учетом чтения инструкции составляет 8 мин. Тестирование проводится индивидуально и в группе, возрастной диапазон испытуемых — от 9 до 60 лет [15].

Литература

1. Альманах психологических тестов. — М. : Изд-во КСП, 1995.

2. Гальперин, П. Я. К проблеме внимания // Хрестоматия по вниманию / под. ред. А. Н. Леонтьева, А. А. Пу-зырея, В. Я. Романова. — М. : Изд-во Моск. ун-та, 1976.

3. Дормашев, Ю. Б. Психология внимания / Ю. Б. Дормашев, В. Я. Романов. — М. : Тривола, 1995.

4. Гиппенрейтер, Ю. Б. Психология внимания / Ю. Б. Гиппенрейтер, В. Я. Романов. — М. : ЧеРо, 2001.

5. Левченко, И. Ю. Психо лого-педагогическая диагностика : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / И. Ю. Левченко, С. Д. Забрамная, Т. А. Добровольская и др.; под ред. И. Ю. Левченко, С. Д. Забрамной. — М. : Академия, 2008.

6. Лубовский, В. И. Общие и специфические закономерности развития психики аномальных детей / В. И. Лубовский // Дефектология. — 1974. — № 6.

7. Рубинштейн, С. Я. Экспериментальные методики патопсихологии и опыт применения их в клинике : (Практ. рук-во) / С. Я. Рубинштейн. — М. : Апрель-Пресс : Изд-во Ин-та психотерапии, 2004.

8. Семаго, Н. Я. Теория и практика оценки психического развития ребенка. Дошкольный и младший школьный возраст / Н. Я. Семаго, М. М. Семаго. — СПб. : Речь, 2005.

9. Ульенкова, У. В. Особенности устойчивости и концентрации произвольного внимания у умственно отсталых учащихся младших классов / У. В. Ульенкова, Л. А. Метиева // Практическая психология и логопедия. — 2007. — № 5 (28).

10. Brähler, Е. Brickenkamp Handbuch psychologischer und pädagogischer Tests : 2 Bd. / E. Brähler, H. Holling, D. Leutner & F. Petermann. — Göttingen : Hogrefe, 2002.

11. Büttner, G. Diagnostik von Konzentration und Aufmerksamkeit / G. Büttner, L. Schmidt-Atzert. — Göttingen : Hofrege, 2004.

12. Eberwein, Manfred Verzeichnis. Testverfahren 2 0. aktualisierte Auflage / Manfred Eberwein ; Leibniz-Zentram für Psychologische Information und Dokumentation Universität Trier. — 2014.— Электрон, дан. — Режим доступа : http://www.zpid.de/pub/tests/verz_einf.pdf.

13. Gamper, Hans. Neuropsycholo-gische Diagnostik bei Kindern und Jugendlichen in Erziehungsberatung und Schulpsychologie / Hans Gamper, Jacqueline Hesse-Meier, Florian Huggler, Manuel Joray, Peider Konz, Ueli Kunz, Beatrice Loder Roncoroni, Ursula Marti, Regula Mathys, Eliane Müller-Fässler, Philipp Ramming, Anna Maria Rüedi, Judith Würth // Praxisforschung der Erziehungsberatung des Kantons Bern (Hrsg.). — Bern, 2004. Bd. 7.

14. Hey de, Gerd. Entwicklung zweier psychometrischer Leistungstests und Validierung ihrer Messgegenstände mit Hilfe eines Modells des menschlichen Gedächtnisses : genehmigte Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Philosophie : защищена 21.

Специальное образование. 2014. № 4

12.2006 / Gerd Heyde. — Darmstadt, 2006.

15. Hogrefe Verlag fur Psychologie [Электронный ресурс]. — Режим доступа: http://www.testzentrale.de/tests/.

16. Milhahn, Elisabeth. Testbatterie zur Aufmerksamkeitsprüfung von Peter Zimmermann und Bruno Fimm / Elisabeth Milhahn, Bernd Inkret. — Электрон, дан. — Режим доступа: http:// www.seelensammler.de/uni/aibeiten/TAP.pdf.

Специальное образование. 2014. № 4

Сканер Python

— используйте библиотеку запросов и xpath для сканирования деталей работы Liepin.com

В последнее время мне нечего было делать, я использую библиотеку запросов python и библиотеку xpath для сканирования информации о найме на Liepin.com. Поскольку это просто практика, нет ограничений на положение, регион и другую информацию.

Один, анализ страницы

1. Анализ вакансии, страница

Щелкните, чтобы войти на страницу Liepin.com, как показано на рисунке ниже: Выше приведены критерии отбора вакансий, а ниже — соответствующий номер страницы

Щелкните другой номер страницы, чтобы просмотреть его URL:
URL-адрес первая страница:
https: // www.liepin.com/zhaopin/?init=-1&headckid=3532b9ea0f3b7d78&fromSearchBtn=2&ckid=3532b9ea0f3b7d78&degradeFlag=0&sfrom=click-pc_homepage-centre_searchbox-search_new&key=&siTag=1B2M2Y8AsgTpgAmY7PhCfg%7EfA9rXquZc5IkJpXC-Ycixw&d_sfrom=search_fp&d_ckId=5c45d39e4043f9abb7a6f0d46a73b85f&d_curPage=1&d_pageSize=40&d_headId=5c45d39e4043f9abb7a6f0d46a73b85f&curPage=0

URL второй страницы:
https://www. liepin.com/zhaopin/?init=-1&headckid=3532b9ea0f3b7d78&fromSearchBtn=2&sfrom=click-pc_homepage-centre_searchbox-search_new&ckid=3532b9ea0f3b7d78&degradeFlag=0&key=&siTag=1B2M2Y8AsgTpgAmY7PhCfg~fA9rXquZc5IkJpXC-Ycixw&d_sfrom= search_fp & d_ckId = 5c45d39e4043f9abb7a6f0d46a73b85f & d_curPage = 0 & d_pageSize = 40 & d_headId = 5c45d39e4043f9abb7a6f0d46a73b85f & curPage = 1

Для сравнения нетрудно обнаружить, что разница между RUL разных страниц — это значение последнего curPage.
Я продолжал щелкать следующую страницу ниже и обнаружил, что могу просматривать до 10 страниц данных без входа в систему.

Следовательно, создайте URL, который будет сканироваться для сканирования:

  для x в диапазоне (100):
    start_url = 'https://www.liepin.com/zhaopin/?isAnalysis=&dqs=&pubTime=&jobTitles=N000075%2CN000082%2CN000077&salary=&subIndustry=&industryType=&compscale=&key=&bearc&index=5987&COMPScale=&key=&cnit&hl=ru¤t&c=&cb&hl=ru&compscale=&key=&cbid&index=1&hl=06 = 15 & ckid = 5331cc6c28c3b7cf & degradeFlag = 0 & jobKind = & отраслей = & clean_condition = & siTag = 1B2M2Y8AsgTpgAmY7PhCfg% 7EfA9rXquZc5IkJpXC-Ycixw & d_sfrom = search_prime & d_ckId = 4a035a6b6d76db17ef8aca969d0a892a & d_curPage = 2 & d_pageSize = 40 & d_headId = 4a035a6b6d76db17ef8aca969d0a892a & curPage = {}». формат (x)

2. Получите URL-адрес страницы сведений о вакансии

Введите элемент обзора списка вакансий

Обнаружив, мы обнаружили, что каждая позиция находится в class = job-info из div Под ярлыком h4 Под ярлыком a Label и URL-адресом сведения о вакансии: a с пометкой href Attributes. Следовательно, нам нужно только получить весь соответствующий атрибут href , он также получает URL-адреса всех страниц с описанием вакансий на этой странице.

  detil_urls = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-info'] // a [@target = '_ blank'] / @ href")

3. Анализ информации о вакансии, страница

Прежде всего, мы видим, что метод запроса на странице сведений о задании такой же, как и метод запроса на странице списка заданий, оба через получают запрос метода.
найдите каждую часть информации, которую мы хотим получить, и получите ее через xpath, как показано ниже:

  title = tree.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h2 / text ()") [0].полоска()
                        company = tree.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h4 / a / text ()") [0] .strip ()
                        salary = tree.xpath ("// p [@ class = 'job-item-title'] / text ()") [0] .strip ()
                        location = tree.xpath ("// p [@ class = 'basic-infor'] / span / text ()") [0] .strip ()
                        times = tree.xpath ("// p [@ class = 'basic-infor'] / time / @ title") [0] .strip ()
                        education = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [1] .strip ()
                        опыт = дерево.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [3] .strip ()
                        language = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [5] .strip ()
                        age = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [7] .strip ()
                        content = tree.xpath ("// div [@ class = 'content-word'] / text ()")
                        content = list (map (лямбда-контент: content.strip (), contents))
                        content = "" .join (содержимое)

На этом этапе все страницы проанализированы и код написан.

Два, написание кода

1. Импортируйте соответствующую библиотеку

  запросов на импорт
из lxml import etree
время импорта
случайный импорт
импорт csv
из случайного выбора импорта

2. Установить прокси и случайный заголовок запроса

Во время сканирования было обнаружено, что при возврате более определенного количества данных возвращаются пустые данные. Предполагается, что веб-сайт мог определить, что этот запрос может быть запросом сканера через IP-адрес или заголовок запроса, поэтому устанавливаются заголовки прокси и случайный запрос.

При настройке прокси я сохранил доступные прокси в файл с именем «https_ips_pool.csv» В этом файле. Код для получения агента следующий:

  def get_proxies (ip_pool_name = 'https_ips_pool.csv'):
    с open (ip_pool_name, 'r') как f:
        datas = f.readlines ()
    ran_num = random.choice (данные)
    ip = ran_num.strip (). split (',')
    прокси = {ip [0]: ip [1] + ':' + ip [2]}
    вернуть прокси

При установке заголовка случайного запроса я установил UA и сохранил соответствующий UA в «user_agent.txt » В файле код для получения заголовка запроса выглядит следующим образом:

  def get_headers ():
    file = open ('user_agent.txt', 'r')
    user_agent_list = file.readlines ()
    user_agent = str (выбор (список_пользователей)). replace ('\ n', '')
    user_agent = "Mozilla / 5.0 (Windows NT 10.0; WOW64) AppleWebKit / 537.36 (KHTML, например, Gecko) Chrome / 78.0.3904.108 Safari / 537.36" if len (user_agent) <20 else user_agent
    заголовки = {
        «Принять»: «текст / html, приложение / xhtml + xml, приложение / xml; q = 0.9, изображение / webp, изображение / apng, * / *; q = 0,8, приложение / подписанный обмен; v = b3 ",
        "Accept-Encoding": "gzip, deflate, br",
        "Accept-Language": "zh-CN, zh; q = 0.9",
        "Cache-Control": "max-age = 0",
        "Connection": "keep-alive",
        "Cookie": «__uuid = 1576743949178,08; need_bind_tel = ложь; new_user = FALSE; c_flag = a99aaaa31f739e3b04d3fa768574cabd; gr_user_id = bdb451db-1bc4-4899-a3b3-410b19c06161; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_last_sent_cs1 = 3872aec89444b8931a667e00ad0d9493; grwng_uid = 6c0a08dc-d2e4-407b-b227-89fe9281943e; fe_work_exp_add = истина; gr_session_id_bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972 = 39311f19-2c25-419e-9a69-64940ae15c78; gr_cs1_39311f19-2c25-419e-9a69-64940ae15c78 = UniqueKey% 3A3872aec89444b8931a667e00ad0d9493; AGL_USER_ID = 15f1f78f-e535-4ccc-8da0-ec0728eb9fb7; abtest = 0; __s_bid = 5ec9f0f87b044308fb05861763266522a1d4; access_system = C; _fecdn_ = 1; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_session_id = b500cb67-657d-4f10-9211-7e69d7e319c4; user_roles = 0; user_photo = 5e7c0e293748374804ud6.jpg; user_name =% E5% B8% B8% E4% BF% 8A% E6% 9D% B0; fe_se = -1587405434042; Hm_lvt_a2647413544f5a04f00da7eee0d5e200 = 1586223102,1586753746,1587356899,1587405434; __tlog = 1587405434243.54% 7C00000000% 7CR000000075% 7C00000000% 7C00000000; UniqueKey = 3872aec89444b8931a667e00ad0d9493; lt_auth = 7bsJaSdWzg% 2Bv4iTRiTBf7fpI3Yr5VmTL% 2FX0Mh0gJh5W6W% 2FWw4PzqRQiDrbIPxAMhwUxzf8ULNLj5Men% 2FznJL7UYQwGmulICyv% 2F2k03sEUeVhIsW2vezHg% 2FXSQp4ilEAC8nJbpEIL% 2BQ% 3D% 3D; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_last_sent_sid_with_cs1 = b500cb67-657d-4f10-9211-7e69d7e319c4; imClientId = deef7ae9f2746887611c3686cabc4d86; imId = deef7ae9f2746887f5aceb762480da5b; imClientId_0 = deef7ae9f2746887611c3686cabc4d86; imId_0 = deef7ae9f2746887f5aceb762480da5b; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_session_id_b500cb67-657d-4f10-9211-7e69d7e319c4 = true; JSESSIONID = 8801E5B4E379482E21B82766ACE7C16F; __uv_seq = 38; __session_seq = 22; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_cs1 = 3872aec89444b8931a667e00ad0d9493; Hm_lpvt_a2647413544f5a04f00da7eee0d5e200 = 1587411721; fe_im_socketSequence_0 = 11_11_11 ",
        "Sec-Fetch-Mode": "переходить",
        "Sec-Fetch-Site": "то же происхождение",
        "Sec-Fetch-User": "? 1",
        "Upgrade-Insecure-Requests": "1",
        "User-Agent": user_agent
    }
    вернуть заголовки

3.Получите URL-адрес страницы с описанием вакансии

Для каждого запроса используются случайный прокси и случайный заголовок запроса.

  def get_detail_url ():
    для x в диапазоне (10):
        start_url = 'https://www.liepin.com/zhaopin/?isAnalysis=&dqs=&pubTime=&jobTitles=N000075%2CN000082%2CN000077&salary=&subIndustry=&industryType=&compscale=&key=&bearc&index=5987&COMPScale=&key=&cnit&hl=ru¤t&c=&cb&hl=ru&compscale=&key=&cbid&index=1&hl=06 = 15 & ckid = 5331cc6c28c3b7cf & degradeFlag = 0 & jobKind = & отраслей = & clean_condition = & siTag = 1B2M2Y8AsgTpgAmY7PhCfg% 7EfA9rXquZc5IkJpXC-Ycixw & d_sfrom = search_prime & d_ckId = 4a035a6b6d76db17ef8aca969d0a892a & d_curPage = 2 & d_pageSize = 40 & d_headId = 4a035a6b6d76db17ef8aca969d0a892a & curPage = {}».формат (x)
        в то время как True:
            прокси = get_proxies ()
            response = requests.get (начальный_курс, заголовки = get_headers (), прокси = прокси)
            если response.status_code == 200:
                response = response.text
                tree = etree.HTML (ответ)
                detil_urls = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-info'] // a [@target = '_ blank'] / @ href")
                parse_url (detil_urls)
                время сна (1)
                сломать

4. Проанализируйте страницу со сведениями о вакансии

При разборе страницы сведений о вакансии было обнаружено несколько проблем:

Сообщения компании и сообщения хедхантеров href Значение атрибута отличается, позиция опубликованной компании href Значением атрибута является полный URL-адрес, а название должности, опубликованное хедхантером href URL-адрес значения атрибута - неполный.
Ярлык одного и того же поля (например, зарплата) различается, когда компания публикует позицию, а хедхантер публикует позицию, поэтому для разных должностей требуется разный анализ.
Некоторые позиции, опубликованные компанией, находятся в "// p [@ class = 'basic-infor'] / span / text ()" Следующий индекс - позиция 0, а некоторые - в индексе 1.

Поэтому, принимая во внимание эти проблемы, выносите суждения и анализируйте их с помощью различных аналитических методов:

 
def parse_url (detil_urls):
    base_url = 'https: // www.liepin.com '
    position_list = []
    для URL в detil_urls:
        если url.startswith ('http'):
            печать (URL)
            в то время как True:
                прокси = get_proxies ()
                пытаться:
                    текст = requests.get (URL, заголовки = get_headers (), прокси = прокси)
                    если text.status_code == 200:
                        текст = текст.текст
                        tree = etree.HTML (текст)
                        title = tree.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h2 / text ()") [0].полоска()
                        company = tree.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h4 / a / text ()") [0] .strip ()
                        salary = tree.xpath ("// p [@ class = 'job-item-title'] / text ()") [0] .strip ()
                        location = tree.xpath ("// p [@ class = 'basic-infor'] / span / text ()")
                        если location [0] .strip () == '':
                            location = location [1] .strip ()
                        еще:
                            location = location [0] .strip ()
                        раз = дерево.xpath ("// p [@ class = 'basic-infor'] / time / @ title") [0] .strip ()
                        education = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [1] .strip ()
                        experience = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [3] .strip ()
                        language = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [5] .strip ()
                        age = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [7] .strip ()
                        содержимое = дерево.xpath ("// div [@ class = 'content-content-word'] / text ()")
                        content = list (map (лямбда-контент: content.strip (), contents))
                        content = "" .join (содержимое)
                        Positions = {
                            "title": название,
                            "компания": компания,
                            "зарплата": зарплата,
                            "location": местоположение,
                            «раз»: раз,
                            «образование»: образование,
                            «опыт»: опыт,
                            "язык": язык,
                            "age": возраст,
                            "содержимое": содержимое
                        }
                        Position_list.добавить (позиции)
                        сломать
                кроме исключения как t:
                    print ("исключение:", t)

        еще:
            url = base_url + url
            печать (URL)
            в то время как True:
                прокси = get_proxies ()
                пытаться:
                    текст = requests.get (URL, заголовки = get_headers (), прокси = прокси)
                    если text.status_code == 200:
                        текст = текст.текст
                        tree = etree.HTML (текст)
                        название = дерево.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h2 / text ()") [0] .strip ()
                        company = tree.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h4 // text ()") [0] .strip ()
                        salary = tree.xpath ("// p [@ class = 'job-main-title'] / text ()") [0] .strip ()
                        location = tree.xpath ("// p [@ class = 'basic-infor'] / span // text ()") [0] .strip ()
                        times = tree.xpath ("// p [@ class = 'basic-infor'] / time / @ title") [0] .strip ()
                        education = tree.xpath ("// div [@ class = 'resume clearfix'] // text ()") [1].полоска()
                        experience = tree.xpath ("// div [@ class = 'resume clearfix'] // text ()") [3] .strip ()
                        language = tree.xpath ("// div [@ class = 'resume clearfix'] // text ()") [5] .strip ()
                        age = tree.xpath ("// div [@ class = 'resume clearfix'] // text ()") [7] .strip ()
                        content = tree.xpath ("// div [@ class = 'content-word'] / text ()")
                        content = list (map (лямбда-контент: content.strip (), contents))
                        содержимое = "".присоединиться (содержание)
                        Positions = {
                            "title": название,
                            "компания": компания,
                            "зарплата": зарплата,
                            "location": местоположение,
                            «раз»: раз,
                            «образование»: образование,
                            «опыт»: опыт,
                            "язык": язык,
                            "age": возраст,
                            "содержимое": содержимое
                        }
                        Position_list.добавить (позиции)
                        сломать
                кроме исключения как t:
                    print ("исключение:", t)

        save_files (список_позиций)
        time.sleep (random.uniform (1, 2))

5. Сохраните просканированную информацию как файл csv

  def save_files (список_позиций):
    заголовки = ['название', 'компания', 'зарплата', 'местонахождение', 'время', 'образование', 'опыт', 'язык', 'возраст', 'содержание']
    с open ("liepin_spider.csv", 'w', encoding = 'utf-8', newline = '') как f:
        писатель = csv.DictWriter (f, заголовки)
        writer.writeheader ()
        для позиций в position_list:
            writer.writerow (должности)
        f.close ()

3. Requests.exceptions.ConnectionError: («Соединение прервано.», LineTooLong («При чтении строки заголовка получено более 65536 байт»,)) обработка исключений

При сканировании всегда было сообщение об ошибке, на устранение которого ушло много времени:

  поднять ошибку соединения (ошибка, запрос = запрос)
Запросы.exceptions.ConnectionError: ('Соединение прервано.', LineTooLong ('При чтении строки заголовка получено более 65536 байт',))

Эта ошибка меня давно беспокоит. Я не знаю причины. Хотя это было окончательно решено, я до сих пор не понял этого. Люди на собрании надеются научить меня.
Решение:

  импорт http.client
http.client._MAXLINE = 524288

В-четвертых, полный код

  запросов на импорт
из lxml import etree
время импорта
случайный импорт
импорт csv
из случайного выбора импорта
импортировать http.клиент
http.client._MAXLINE = 524288

base_url = 'https://www.liepin.com'
position_list = []
я = 0
г = 0

def get_proxies (ip_pool_name = 'https_ips_pool.csv'):
    с open (ip_pool_name, 'r') как f:
        datas = f.readlines ()
    ran_num = random.choice (данные)
    ip = ran_num.strip (). split (',')
    прокси = {ip [0]: ip [1] + ':' + ip [2]}
    вернуть прокси

def get_headers ():
    file = open ('user_agent.txt', 'r')
    user_agent_list = file.readlines ()
    user_agent = str (выбор (user_agent_list)).заменить ('\ n', '')
    user_agent = "Mozilla / 5.0 (Windows NT 10.0; WOW64) AppleWebKit / 537.36 (KHTML, например, Gecko) Chrome / 78.0.3904.108 Safari / 537.36" if len (user_agent) <20 else user_agent
    заголовки = {
                  «Принять»: «text / html, application / xhtml + xml, application / xml; q = 0.9, image / webp, image / apng, * / *; q = 0.8, application / signed-exchange; v = b3»,
                  "Accept-Encoding": "gzip, deflate, br",
        "Accept-Language": "zh-CN, zh; q = 0.9",
        "Connection": "keep-alive",
        «Cookie»: «__uuid = 1576743949178.08; need_bind_tel = ложь; new_user = ложь; c_flag = a99aaaa31f739e3b04d3fa768574cabd; gr_user_id = bdb451db-1bc4-4899-a3b3-410b19c06161; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_last_sent_cs1 = 3872aec89444b8931a667e00ad0d9493; grwng_uid = 6c0a08dc-d2e4-407b-b227-89fe9281943e; fe_work_exp_add = правда; gr_session_id_bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972 = 39311f19-2c25-419e-9a69-64940ae15c78; gr_cs1_39311f19-2c25-419e-9a69-64940ae15c78 = Уникальный ключ% 3A3872aec89444b8931a667e00ad0d9493; AGL_USER_ID = 15f1f78f-e535-4ccc-8da0-ec0728eb9fb7; __s_bid = 5ec9f0f87b044308fb05861763266522a1d4; imClientId = deef7ae9f2746887611c3686cabc4d86; imId = deef7ae9f2746887f5aceb762480da5b; imClientId_0 = deef7ae9f2746887611c3686cabc4d86; imId_0 = deef7ae9f2746887f5aceb762480da5b; abtest = 0; fe_se = -1588144304556; Hm_lvt_a2647413544f5a04f00da7eee0d5e200 = 1587405434,1587440994,1587693344,1588144305; UniqueKey = 3872aec89444b8931a667e00ad0d9493; lt_auth = vukLOidWzg% 2Bv4iTRiTBf7fpI3Yr5VmTL% 2FX0Mh0gJh5W6W% 2FWw4PzqRQiDrbIPxAMhxxMmI8ULNLj2NOz3wHVI70IveznLj2NOz3wHVI70IveznLj2NOz3wHVI70IveznGmul% access_system = C; user_roles = 0; user_photo = 5e7c0e2937483e328d66574804u.jpg; user_name =% E5% B8% B8% E4% BF% 8A% E6% 9D% B0; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_session_id = 01e3d74e-99ae-4fbf-af09-101908fa9115; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_last_sent_sid_with_cs1 = 01e3d74e-99ae-4fbf-af09-101908fa9115; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_session_id_01e3d74e-99ae-4fbf-af09-101908fa9115 = true; __tlog = 1588144304624.83% 7C00000000% 7CR000000058% 7Cs_00_t00% 7Cs_00_t00; JSESSIONID = A6BB05126EF05E24DC5F8E80F0D3FFFE; __uv_seq = 23; __session_seq = 23; bad1b2d9162fab1f80dde1897f7a2972_gr_cs1 = 3872aec89444b8931a667e00ad0d9493; Hm_lpvt_a2647413544f5a04f00da7eee0d5e200 = 1588151024; fe_im_socketSequence_0 = 6_6_6 ",
        «Хост»: «www.liepin.com ",
        "Referer": "https://www.liepin.com/zhaopin/?industries=&subIndustry=&dqs=&salary=&jobKind=&pubTime=&compkind=&compscale=&industryType=&searchType=1&clean_condition=&fromlagis=&fromlagys=&fromlagys=&fromlagys=&fromlagys=&fromlag9 1 & headckid = b8fa977dd1f04136 & d_headId = 83d82171062d54a659301a2193fa9e67 & d_ckId = 83d82171062d54a659301a2193fa9e67 & d_sfrom = search_fp_bar & d_curPage = 0 & d_pageSize = 40 & siTag = bbL6aoW_xGX8iD8Yj4vLYw% 7EfA9rXquZc5IkJpXC-Ycixw & ключ =»,
        "Sec-Fetch-Mode": "переходить",
        "Sec-Fetch-Site": "то же происхождение",
        "Sec-Fetch-User": "? 1",
        "Upgrade-Insecure-Requests": "1",
        "User-Agent": user_agent
    }
    вернуть заголовки


def get_detail_url ():
    для x в диапазоне (100):
        start_url = 'https: // www.liepin.com/zhaopin/?isAnalysis=&dqs=&pubTime=&jobTitles=N000075%2CN000082%2CN000077&salary=&subIndustry=&industryType=&compscale=&key=&init=-1&searchType=1&headckid=5331cc6c28c3b7cf&compkind=&fromSearchBtn=2&sortFlag=15&ckid=5331cc6c28c3b7cf&degradeFlag=0&jobKind=&industries= & clean_condition = & siTag = 1B2M2Y8AsgTpgAmY7PhCfg% 7EfA9rXquZc5IkJpXC-Ycixw & d_sfrom = search_prime & d_ckId = 4a035a6b6d76db17ef8aca969d0a892a & d_curPage = 2 & d_pageSize = 40 & d_headId = 4a035a6b6d76db17ef8aca969d0a892a & curPage = {}».формат (x)
        печать (start_url)
        глобальный z
        г + = 1
        print ("Теперь это номер один" + str (z) + "page!")
        в то время как True:
            прокси = get_proxies ()
            response = requests.get (начальный_курс, заголовки = get_headers (), прокси = прокси)
            если response.status_code == 200:
                response = response.text
                tree = etree.HTML (ответ)
                detil_urls = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-info'] // a [@target = '_ blank'] / @ href")
                parse_url (detil_urls)
                время.спать (1)
                сломать


def parse_url (detil_urls):
    j = 0
    глобальный z
    глобальный base_url
    глобальный список позиций
    для URL в detil_urls:
        если url.startswith ('http'):
            печать (URL)
            в то время как True:
                прокси = get_proxies ()
                пытаться:
                    текст = requests.get (URL, заголовки = get_headers (), прокси = прокси)
                    если text.status_code == 200:
                        текст = текст.текст
                        дерево = etree.HTML (текст)
                        title = tree.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h2 / text ()") [0] .strip ()
                        company = tree.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h4 / a / text ()") [0] .strip ()
                        salary = tree.xpath ("// p [@ class = 'job-item-title'] / text ()") [0] .strip ()
                        location = tree.xpath ("// p [@ class = 'basic-infor'] / span / a / text ()")
                        если location [0] .strip () == '':
                            location = location [1] .strip ()
                        еще:
                            location = location [0].полоска()
                        
                        education = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [1] .strip ()
                        experience = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [3] .strip ()
                        language = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [5] .strip ()
                        age = tree.xpath ("// div [@ class = 'job-qualifications'] // text ()") [7] .strip ()
                        content = tree.xpath ("// div [@ class = 'content-word'] / text ()")
                        content = list (map (lambda content: content.полоса (), содержимое))
                        content = "" .join (содержимое)
                        Positions = {
                            "title": название,
                            "компания": компания,
                            "зарплата": зарплата,
                            "location": местоположение,
                            
                            «образование»: образование,
                            «опыт»: опыт,
                            "язык": язык,
                            "age": возраст,
                            "содержимое": содержимое
                        }
                        Position_list.добавить (позиции)
                        сломать
                кроме исключения как t:
                    print ("исключение:", t)

        еще:
            url = base_url + url
            печать (URL)
            в то время как True:
                прокси = get_proxies ()
                пытаться:
                    текст = requests.get (URL, заголовки = get_headers (), прокси = прокси)
                    если text.status_code == 200:
                        текст = текст.текст
                        tree = etree.HTML (текст)
                        название = дерево.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h2 / text ()") [0] .strip ()
                        company = tree.xpath ("// div [@ class = 'title-info'] / h4 // text ()") [0] .strip ()
                        salary = tree.xpath ("// p [@ class = 'job-main-title'] / text ()") [0] .strip ()
                        location = tree.xpath ("// p [@ class = 'basic-infor'] / span // text ()") [0] .strip ()
                        
                        education = tree.xpath ("// div [@ class = 'resume clearfix'] // text ()") [1] .strip ()
                        опыт = дерево.xpath ("// div [@ class = 'resume clearfix'] // text ()") [3] .strip ()
                        language = tree.xpath ("// div [@ class = 'resume clearfix'] // text ()") [5] .strip ()
                        age = tree.xpath ("// div [@ class = 'resume clearfix'] // text ()") [7] .strip ()
                        content = tree.xpath ("// div [@ class = 'content-word'] / text ()")
                        content = list (map (лямбда-контент: content.strip (), contents))
                        content = "" .join (содержимое)
                        Positions = {
                            "title": название,
                            "компания": компания,
                            "зарплата": зарплата,
                            "location": местоположение,
                            
                            «образование»: образование,
                            «опыт»: опыт,
                            "язык": язык,
                            "age": возраст,
                            "содержимое": содержимое
                        }
                        Position_list.добавить (позиции)
                        сломать
                кроме исключения как t:
                    print ("исключение:", t)

        j + = 1
        print («Добавить раздел» + str (z) + «Страница, первая» + str (j) + «Данные статьи!»)
        глобальный я
        я + = 1
        print ("Итого" + str (i) + "Данные статьи!")
        save_files (список_позиций)
        time.sleep (random.uniform (1, 2))



def save_files (список_позиций):
    заголовки = ['название', 'компания', 'зарплата', 'местонахождение', 'образование', 'опыт', 'язык', 'возраст', 'содержание']
    с открытым ("liepin_spider.csv ", 'w', encoding = 'utf-8', newline = '') как f:
        Writer = csv.DictWriter (f, заголовки)
        writer.writeheader ()
        для позиций в position_list:
            writer.writerow (должности)
        f.close ()


если __name__ == '__main__':
    get_detail_url ()

Гусеничный робот Python Scrapy сканирует информацию о вакансиях

Для выполнения школьного домашнего задания по Hadoop в наши дни необходимы некоторые данные, поэтому я узнал о фреймворке сканера Python: Scrapy
сканировал данные о вакансиях фронтенд-программистов в популярных городах Лиепина.com

Проект строительства

pip3 установить Scrapy
pip3 установить изнаночную
scrapy startproject boss (название проекта)
Структура проекта:

ps: части в красном кружке - ненужные файлы, не беспокойтесь

На самом деле, я сначала хотел нанять босса напрямую, но босса наняли с помощью анти-рептилий, поэтому я обратился к охоте

Написание кода

liepin.py Это файл краулера

  импортный лом
из ..items import BossItem
время импорта
импортировать json
импорт uuid
из Furl Import Furl

класс BossSpider (scrapy.Spider):

    name = 'liepin'
    allowed_domains = ['www.liepin.com']
    city_code_list = ['050090', '030', '060080', '040', '060020', '070020', '210040', '280020', '170020', '050050', '020', '010' , '050020']
    query = 'интерфейс'
    F = furl ('https://www.liepin.com/zhaopin/?')
    meta = {
        'dont_redirect': Верно,
        'handle_httpstatus_list': [302]
    }
    
    заголовки = {
        'x-devtools-emulate-network-conditions-client-id': "5f2fc4da-c727-43c0-aad4-37fce8e3ff39",
        'upgrade-insecure-requests': "1",
        'user-agent': «Mozilla / 5.0 (Windows NT 10.0; Win64; x64) AppleWebKit / 537.36 (KHTML, как Gecko) Chrome / 84.0.4147.30 Safari / 537.36 Edg / 84.0.522.11 ",
        'accept': "text / html, application / xhtml + xml, application / xml; q = 0.9, image / webp, image / apng, * / *; q = 0.8",
        'dnt': "1",
        "sec-fetch-user": "? 1",
        "sec-fetch-site": "то же происхождение",
        'accept-encoding': "gzip, deflate",
        'accept-language': "zh-CN, zh; q = 0,8, en; q = 0,6",
        'cookie': "_uab_collina = 15111970617015; __c = 15732; __g = -; lastCity = 100010000; __l = l =% 252Fjob_detail% 252F% 253Fcity% 253D101280100% 2526query% 25825D% 2525E% 2526query% 253D725D% 2525E% 2526page% 253D1 & г = & friend_source = 0 & friend_source = 0; Hm_lvt_194df3105ad7148dcf2b98a91b5e727a = 15112,15747; __zp__pub __ =; __zp_stoken __ = d333RVRKN8UIhmLd% 2F% 2B7kh% 2BaVhbOrMOdXfCkzw7% 2B% 2F2T8s% 2FwZ2dz4Gari8l2BhfUHZuzdMt0n4jTe4yRt9% 2FvyKvss1VpAkwNncjZiSFt1Ji6s% 2F7vThhwg9q% 2FnfuRUba5dkikgF; __a = 14.15112.15112.15732.59.2.13.59; Hm_lpvt_194df3105ad7148dcf2b98a91b5e727a = 15455 ",
        'cache-control': "no-cache"}

    def parse (self, response):
        для c в self.city_code_list:
            yield self.request_city (c)

    
    def request_city (self, city_code, page = 0):
        url_data = {
            'dqs': city_code,
            'ключ': self.query,
            'curPage': страница
        }
        
        url = self.F.copy (). add (url_data) .url
        print ('Начать сканирование' + str (city_code) + 'First' + str (page) + 'page')
        req = scrapy.Запрос (url, callback = self.get_data, dont_filter = False, headers = self.headers)
        
        req.meta ['city_code'] = city_code
        req.meta ['page'] = страница
        запрос на возврат

    
    def get_data (self, response):
        job_list = response.css ('div.job-content> div.sojob-result> ul.sojob-list> li')
        для работы в job_list:
            item = BossItem ()
            элемент ['name'] = job.css (
                'div.sojob-item-main> div.job-info> h4> a :: text'). extract_first ().полоска()
            item ['xueli'] = job.css ('div.sojob-item-main> div.job-info> p.condition> span.edu::text'). extract_first (). strip ()
            item ['salary'] = job.css ('div.sojob-item-main> div.job-info> p.condition> span.text-warning :: text') .extract_first (). strip ()
            a = job.css (
                'div.sojob-item-main> div.job-info> p.condition> a.area :: text') .extract_first ()
            если! = Нет:
                item ['area'] = a.strip ()
            еще:
                item ['area'] = 'Ничего'
            item ['pid'] = str (uuid.uuid1 ())
            доходный пункт

        city_name = response.meta ['city_code']
        page = response.meta ['страница']
        если job_list:
            
            время сна (20)
            yield self.request_city (city_name, page = page + 1)

item.py сохраняет поле доходности

  импортный лом


класс BossItem (scrapy.Item):
    
    имя = scrapy.Field ()
    pid = scrapy.Field ()
    зарплата = scrapy.Field ()
    xueli = scrapy.Field ()
    area = scrapy.Поле()
    проходить

pipelines.py используется для вывода просканированных данных в файл. Также это может быть файл в других форматах. Принцип аналогичен, поэтому я не буду их здесь повторять.

  импорт ОС
класс BossPipeline (объект):
    def process_item (я, предмет, паук):
        
        base_dir = os.getcwd ()
        fiename = base_dir + '/news.txt'
        
        с open (fiename, 'a') как f:
            f.write (элемент ['pid'] + '\ t')
            f.write (элемент ['имя'] + '\ t')
            f.написать (элемент ['xueli'] + '\ t')
            f.write (элемент ['область'] + '\ t')
            f.write (элемент ['зарплата'] + '\ n')
        вернуть изделие

Добавьте в setting.py:

  ITEM_PIPELINES = {
   'boss.pipelines.BossPipeline': 300
}

Гусеничный ход

Выполнить в корневом каталоге проекта: scrapy crawl liepin (имя поискового робота, определенное в файле искателя)
После завершения операции откройте сгенерированный файл news.txt и получите следующий результат:

Обновить выходные данные класса как.csv файл:

  импорт CSV

класс toCsv (объект):

    def __init __ (сам):
        
        self.f = open ("myproject.csv", "a", newline = "")
        
        self.fieldnames = ["pid", "name", "area", "xueli", "salary"]
        
        self.writer = csv.DictWriter (self.f, fieldnames = self.fieldnames)
        
        self.writer.writeheader ()

    def process_item (я, предмет, паук):
        
        self.writer.writerow (элемент)
        
        вернуть изделие

    def close (self, spider):
        себя.f.close ()

Создайте его как toCsv.py и настройте в settings.py:

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Введение грибкового пути d-галактуроната делает возможным потребление d-галактуроновой кислоты Saccharomyces cerevisiae

Microb Cell Fact. 2016; 15: 144.

, ^1, ³, ^1, ², ³, ³, ⁴, ¹ и ³ 9000iz4 A ¹ Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Федеральный университет Параны, Сх.P. 19046 Centro Politécnico, Curitiba, PR 81531-980 Brazil

³ VTT Technical Research Center of Finland Ltd, P.O. Box 1000, 02044 VTT Espoo, Finland

Maura Harumi Sugai-Guérios

¹ Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná, Cx. P. 19046 Centro Politécnico, Curitiba, PR 81531-980 Brazil

² Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina, Cx.P. 476 Reitor Campus João David Ferreira Lima, Florianópolis, SC 88040-970 Brazil

Joosu Kuivanen

³ VTT Technical Research Center of Finland Ltd, P.O. Box 1000, 02044 VTT Espoo, Finland

Hannu Maaheimo

³ VTT Technical Research Center of Finland Ltd, P.O. Box 1000, 02044 VTT Espoo, Finland

Nadia Krieger

⁴ Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná, Cx. P. 19081 Centro Politécnico, Curitiba, PR 81531-980 Brazil

David Alexander Mitchell

¹ Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Федеральный университет Параны, Cx.P. 19046 Centro Politécnico, Curitiba, PR 81531-980 Brazil

Peter Richard

³ VTT Technical Research Center of Finland Ltd, P.O. Box 1000, 02044 VTT Espoo, Finland

¹ Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná, Cx. P. 19046 Centro Politécnico, Curitiba, PR 81531-980 Brazil

² Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina, Cx.P. 476 Настоятель кампуса Жоао Давид Феррейра Лима, Флорианополис, SC 88040-970 Бразилия

³ VTT Technical Research Center of Finland Ltd, P.O. Box 1000, 02044 VTT Espoo, Finland

⁴ Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná, Cx. P. 19081 Centro Politécnico, Curitiba, PR 81531-980 Brazil

Автор, ответственный за переписку.

Поступило 14 апреля 2016 г .; Принято 10 августа 2016 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется на условиях Creative Commons Attribution 4.0 Международная лицензия (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что вы должным образом укажете первоначального автора (авторов) и источник, предоставьте ссылку на лицензию Creative Commons и укажите, были ли внесены изменения. Отказ Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) распространяется на данные, представленные в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Реферат

Предпосылки

Отходы, богатые пектином, такие как мякоть цитрусовых и пульпа сахарной свеклы, в значительных количествах производятся соковой и сахарной промышленностью и могут быть использованы в качестве сырья для биоперерабатывающих заводов. Одним из возможных процессов на таких предприятиях биопереработки является гидролиз этих отходов и последующее производство этанола. Однако выбранный организм, продуцирующий этанол, Saccharomyces cerevisiae , не способен катаболизировать d-галактуроновую кислоту, которая представляет собой значительное количество сахаров в гидролизате, а именно 18% (мас. / Мас.) Из мякоти цитрусовых и 16% (мас.) Жома сахарной свеклы.

Результаты

В данной работе мы описываем конструирование штамма S. cerevisiae , в котором пять генов грибкового редуктивного пути катаболизма d-галактуроновой кислоты были интегрированы в хромосомы дрожжей: гаа A , gaa C и gaa D из Aspergillus niger и lgd 1 из Trichoderma reesei, и недавно описанный белок-транспортер d-галактуроновой кислоты, gat 1, из ssa ssa Neurospo.Этот штамм метаболизировал d-галактуроновую кислоту в среде, содержащей d-фруктозу в качестве вспомогательного субстрата.

Заключение

Эта работа является первой демонстрацией экспрессии функционального гетерологичного пути катаболизма d-галактуроновой кислоты у Saccharomyces cerevisiae . Это предварительный этап создания дрожжевого штамма для ферментации богатых пектином субстратов до этанола.

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (doi: 10.1186 / s12934-016-0544-1) содержит дополнительные материалы, доступные авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Этанол, d-галактуроновая кислота, Saccharomyces cerevisiae, Мякоть цитрусовых, Метаболическая инженерия

Предпосылки

Мякоть цитрусовых и жом сахарной свеклы - это богатые пектином отходы, которые производятся в значительных количествах в различных странах. Мякоть цитрусовых получается в результате производства концентрата апельсинового сока. Его производство сосредоточено в основном в Бразилии и США, на которые приходится 54 и 26% мирового рынка соответственно [1].В урожае 2014/2015 гг. В этих двух странах было произведено 1,4 млн тонн концентрата апельсинового сока (65 ° Brix) [1], и это количество приведет к производству около 1,9 млн метрических тонн мякоти цитрусовых (сухое вещество). . Аналогичным образом, большое количество жома сахарной свеклы образуется при извлечении сахара из сахарной свеклы в странах с умеренным климатом, особенно в России, США и некоторых европейских странах [2]. В урожае 2013 года во всем мире было произведено 246 миллионов метрических тонн сахарной свеклы [2], в результате чего получилось 12.3 миллиона метрических тонн свекольного жома (в сухом веществе).

Мякоть цитрусовых и жом сахарной свеклы обычно продаются для добавления в корм скоту, но затраты на сушку этих отходов делают это применение малоприбыльным [3]. С другой стороны, эти отходы являются потенциально важными источниками углеводов, которые могут использоваться в качестве сырья на предприятиях биопереработки для производства химикатов на биологической основе и биотоплива. Фактически, существует растущий спрос на этанол, особенно в Бразилии и США, и биоперерабатывающие заводы, использующие отходы цитрусовых или жом сахарной свеклы, могут частично удовлетворить этот спрос [4, 5].Однако гидролизаты, полученные из отходов, богатых пектином, имеют высокое содержание d-галактуроновой кислоты, что составляет 18% (мас. / Мас.) Гидролизатов цитрусовых отходов [6] и 16% (мас. / Мас.) Гидролизатов жома сахарной свеклы [7] . К сожалению, эта уроновая кислота не катаболизируется Saccharomyces cerevisiae , который является предпочтительным микроорганизмом для производства этанола.

И наоборот, многие микроорганизмы, которые могут использовать d-галактуроновую кислоту, не производят этанол в заметных количествах. Escherichia coli , например, имеет изомеразный путь катаболизма d-галактуроновой кислоты, но из-за низкой толерантности к этанолу и ингибиторам он не является предпочтительным организмом для производства этанола.С другой стороны, производство этанола с использованием S. cerevisiae уже является высокопроизводительным и надежным процессом. Эти дрожжи предпочтительны для производства этанола в промышленных масштабах по нескольким причинам, включая устойчивость к загрязнителям, бактериофагам, ингибиторам и низкий pH [8]. Он также выдерживает более высокое осмотическое давление, что позволяет использовать концентрированную культуральную среду и более высокие концентрации этанола. Учитывая это, экспрессия гетерологичного пути катаболизма d-галактуроновой кислоты в S.cerevisiae вместо инженерных бактерий для производства этанола является предпочтительным путем для промышленного производства этанола из гидролизатов, содержащих d-галактуроновую кислоту.

С этой целью были использованы различные подходы для создания S. cerevisiae . Huijes et al. [9], например, введены путем интеграции в хромосомы пять генов бактериального изомеразного пути ( uxa C, uxa B, uxa A, кдг K и кдг A), которые конвертируют d-галактуроновая кислота в пируват и глицеральдегид-3-фосфат.Хотя Huijes et al. [9] с помощью кПЦР продемонстрировали, что все гены транскрибируются, только два фермента этого пути проявляют детектируемую активность после интеграции в S. cerevisiae . В другом подходе Суффрио [10] экспрессировал грибковый путь катаболизма d-галактуроновой кислоты в S. cerevisiae путем клонирования четырех генов этого пути ( gar 1, lgd 1, lga 1 и gld 1, из Trichoderma reesei ) в двух плазмидах с разрывом - DH - ADH 1 двунаправленным промотором.В этой работе активность всех гетерологичных ферментов была обнаружена в клеточном лизате. Несмотря на это, рекомбинантный штамм дрожжей не потреблял d-галактуроновую кислоту.

В данной работе мы расширили работу Soufriau [10], интегрировав в дрожжевые хромосомы четыре гена редуктивного катаболического пути d-галактуроновой кислоты у грибов; Кроме того, мы также интегрировали недавно обнаруженный переносчик d-галактуроновой кислоты из Neurospora crassa , чтобы создать дрожжи, которые могут использовать d-галактуроновую кислоту в качестве источника углерода.Эта работа представляет собой важный шаг в создании штамма S. cerevisiae , способного производить этанол из d-галактуроновой кислоты.

Результаты

Сборка пути и экспрессия гена

Грибковый путь катаболизма d-галактуроновой кислоты был экспрессирован в штамме Saccharomyces cerevisiae CEN.PK111-61A, гены которого были выбраны из трех разных нитчатых грибов, Aspergillus , Trichoderma reesei и Neurospora crassa .

В качестве первого шага четыре гена, кодирующие катаболический путь d-галактуроната в A. niger ( gaa A, gaa B, gaa C и gaa D), были интегрированы в хромосомы дрожжей, причем каждый из них экспрессируется под сильными и конститутивными дрожжевыми промоторами ( PGK 1 или TPI 1). Соответствующие ферментативные активности га A, га C и га D были обнаружены в клеточном лизате. Соответствующая активность gaa B, а именно l-галактонатдегидратазы, не была обнаружена, даже когда использовалась оптимизированная по кодонам ORF gaa B.Этот результат был неожиданным, поскольку активность gaa B была продемонстрирована при экспрессии в мультикопийном экспрессионном векторе [11]. Учитывая это, вместо этого использовали lgd 1, ген, кодирующий l-галактонатдегидратазу, из T. reesei . Полученный штамм (h5531), имеющий интегрированный полный путь ( gaa A, gaa C, gaa D и lgd 1), был затем повторно протестирован на активность всех четырех ферментов. Ферментативные активности, полученные от h5531, перечислены в таблице.

Таблица 1

Активность ферментов, определенная для лизата клеток S. cerevisiae h5531

Фермент	Ген	Спец. Действовать. (нкат / мг)
EC 1.1.1.365	гаа A	0,246
EC 4.2.1.146	LGD 1	0,018
EC 4.1.2.B7	гаа C	0,274
EC 1.1.1.372	gaa D	1.139

В ходе исследования переносчик d-галактуроновой кислоты (кодируется gat 1) был описан у N. crassa [12]. Хотя в предыдущем исследовании сообщалось, что природный S. cerevisiae способен импортировать d-галактуроновую кислоту при выращивании при кислых значениях pH [13], введение переносчика может улучшить потребление, особенно при более высоких значениях pH. По этой причине g at 1- Ген слитого белка gfp был интегрирован в h5531, в результате чего был получен штамм h5535.Расположение GAT1 было подтверждено флуоресцентной микроскопией, при этом зеленая флуоресценция GFP наблюдалась в плазматической мембране.

Потребление d-галактуроновой кислоты

Оба сконструированных штамма, h5531 и h5535, культивировали в течение 5 дней в аэробных условиях в среде YP с добавлением 12 г L ^-1 d-галактуроновой кислоты. В качестве контроля использовали штамм CEN.PK113-1A S. cerevisiae , не имеющий ауксотрофий. Даже после адаптивной лабораторной эволюции рекомбинантные штаммы, а также контрольный штамм плохо росли и не потребляли d-галактуроновую кислоту в этих условиях.

Таким образом, была проведена вторая ферментация с той разницей, что в среду было добавлено 80 г L ^-1 d-фруктозы (рис.). На этот раз 20% d-галактуроновой кислоты потреблялось штаммом дрожжей h5535, который экспрессировал четыре гена восстановительного пути и переносчик d-галактуроновой кислоты. Примечательно, что большая часть этого потребления наблюдалась в первые 24 часа и соответствует полной утилизации d-фруктозы дрожжами. Потребление d-галактуроновой кислоты было незначительным для контрольного штамма и рекомбинантного штамма, экспрессирующего восстановительный путь, но не имеющего переносчика.Мы также могли исключить, что d-галактуроновая кислота просто превращалась в l-галактонат или другие промежуточные соединения галактуронатного пути, поскольку эти метаболиты не были обнаружены ни в культуральной среде, ни в клеточном экстракте. Помимо явной разницы в потреблении d-галактуроновой кислоты, все остальные измеренные параметры, такие как этанол, биомасса, pH и d-фруктоза, существенно не различались между штаммами.

Культивирование штаммов дрожжей в d-галактуроновой кислоте и d-фруктозе.Контроль - h3806 (CEN.PK 113-1A), h5531 содержит гены gaa A, lgd 1, gaaC и gaa D, а h5535 содержит гены gaa A, lgd gaa C, gaa D и gat 1. a потребление d-галактуроновой кислоты. b Производство этанола и глицерина, потребление фруктозы. c Производство биомассы ( закрытых маркеров ) и pH ( открытых маркеров ). Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего значения

Для дальнейшего анализа роли d-фруктозы как вспомогательного субстрата, обеспечивающего потребление d-галактуроновой кислоты, была проведена дополнительная ферментация.Здесь d-фруктоза была добавлена двумя партиями по 40 г L ^-1, вторая - через 72 часа (рис.). С помощью этого эксперимента можно было наблюдать, что дополнительное потребление галактуроновой кислоты следует за добавлением фруктозы через 72 часа.

Культивирование в d-галактуроновой кислоте и d-фруктозе со вторым добавлением d-фруктозы. Контроль - h3806 (CEN.PK 113-1A), а h5535 содержит гены gaa A, lgd 1, gaa C, gaa D и gat 1.Ферментацию проводили с d-фруктозой в качестве вспомогательного субстрата, при этом вторую загрузку d-фруктозы добавляли через 72 часа ферментации. Потребление d-галактуроновой кислоты контролировали с течением времени. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего

Наконец, чтобы доказать, что галактуроновая кислота определенно катаболизируется модифицированными дрожжами, а не только превращается, например, в l-галактоната, судьбу этого сахара контролировали с помощью ЯМР, используя в качестве субстрата однородно меченый d- [UL- ¹³ C ₆] галактуронат.Для этого проводили ферментацию с 40 г L ^-1 d-фруктозы и 4 г L ^-1 d-галактуроновой кислоты, при этом меченый субстрат соответствовал половине общего количества d-галактуроновой кислоты. Опять же, контрольный штамм без пути ферментации ферментировали в тех же условиях. На рис. A, b показан спектр ЯМР супернатанта этой ферментации через 24 часа, соответствующий спектру супернатанта контрольного штамма и B сконструированного штамма с грибковым путем и переносчиком.На рис. B имеется четкий сигнал однородно меченого глицерина, демонстрирующий тонкую структуру скалярной связи ¹³ C- ¹³ C, что означает, что углеродный скелет был первоначально из меченой d-галактуроновой кислоты. На рис. А этот полностью меченый глицерин не обнаруживается в спектре. Глицерин является продуктом пути d-галактуроновой кислоты и катаболизма сахаров в дрожжах и был обнаружен с помощью ВЭЖХ как для контрольных, так и для сконструированных штаммов в предыдущих экспериментах. Обнаружение однородно меченного ¹³ C глицерина уже подтверждает, что d-галактуроновая кислота метаболизируется сконструированным штаммом, а не контролем.Однако, чтобы еще раз убедиться, что d-галактуроновая кислота метаболизируется, дрожжевые клетки собирали через 96 часов ферментации и гидролизовали. Спектр полученных аминокислот анализировали как для контрольного штамма (рис. C), так и для сконструированного штамма (рис. D). Также здесь мы наблюдали тонкую структуру скалярной связи ¹³ C- ¹³ C в образце сконструированного штамма, доказывая, что меченый углерод происходит из d-галактуроновой кислоты. Альфа-углерод нескольких амино является ¹³ C-меченым и имеет ¹³ C-меченых соседей в сконструированном штамме, но не в контрольном штамме, что является доказательством того, что d-галактуроновая кислота катаболизируется и попадает в биомасса инженерного штамма.

ЯМР-анализ трассирующих ферментаций ¹³ C. Расширения спектров HSQC a супернатанта культуры контрольного штамма h3806 (CEN.PK 113-1A) и b штамма h5535, содержащего гены gaa A, lgd 1, gaa C, gaa D и gat 1. Сигналы глицерина, производимые h5535, выделены красным цветом , а вставки показывают поперечные сечения этих сигналов вдоль F1, показывая тонкую структуру скалярной связи ¹³ C- ¹³ C. .Эти сигналы не были обнаружены для контрольного штамма. Часть альфа-углеродной области спектров HSQC гидролизата биомассы c контрольного штамма и d инженерного штамма, демонстрируя тонкую структуру скалярной связи ¹³ C- ¹³ C в большинстве сигналов

Обсуждение

В этой работе мы впервые демонстрируем функциональный катаболический путь потребления d-галактуроната S. cerevisiae . Для этого грибковый путь d-галактуроновой кислоты и переносчик d-галактуроновой кислоты были интегрированы в хромосомы дрожжей, и соответствующая ферментативная активность была показана в клеточном лизате, а переносчик d-галактуроновой кислоты локализован в клеточной мембране. .Испытания ферментации с d-фруктозой в качестве дополнительного субстрата показали, что сконструированный штамм, кроме того, был способен катаболизировать d-галактуроновую кислоту. Отслеживание ¹³ C из однородно меченой d-галактуроновой кислоты показало, что эти атомы углерода попадают в продукты ферментации, особенно в глицерин, и в аминокислоты биомассы.

Грибковый путь катаболизма d-галактуроновой кислоты был недавно открыт Hilditch et al. [14] и подтверждено Martens-Uznova et al.[15]. Он состоит из четырех ферментов с двумя стадиями восстановления (рис.). Первый фермент пути, d-галактуронатредуктаза (EC 1.1.1.365), кодируемый gaaA в A. niger , превращает d-галактуронат в l-галактонат, используя NADPH или NADH в качестве донора электронов. l-галактонатдегидратаза (EC 4.2.1.146), кодируемая gaaB в A. niger и lgd 1 в T. reesei , превращает l-галактонат в 2-кето-3-дезоксигалактонат. Третий фермент, 2-кето-3-дезоксигалактонатальдолаза (EC 4.1.2.B7), кодируемый gaa C в A. niger , разделяет 2-кето-3-дезоксигалактонат между атомами углерода 3 и 4, образуя пируват и l-глицеральдегид. Пируват может входить в цикл лимонной кислоты, в то время как l-глицеральдегид превращается в глицерин с помощью глицеральдегидредуктазы (EC 1.1.1.372, кодируется гаа D в A. niger ) с использованием НАДФН в качестве донора электронов.

Грибковый путь катаболизма d-галактуроновой кислоты

Недавно Benz [12] описал переносчик d-галактуроновой кислоты, который предположительно действует как симпортер H ⁺ / d-галактуроновой кислоты.Соответствующий ген был обнаружен в Neurospora crassa, , и для дальнейшего подтверждения его функциональности переносчик также коэкспрессировался в дрожжах с первым ферментом грибкового пути, галактуронатредуктазой ( га, A).

Souffriau [10], аналогично тому, что мы сделали, также экспрессировал гены грибкового пути от Trichoderma reesei ( gar 1, lgd 1, lga 1 и gld 1) в S. cerevisiae. В отличие от нашего подхода, четыре гена были экспрессированы из двух плазмид с разрывом - DH - ADH 1 двунаправленным промотором. Несмотря на то, что активность всех ферментов проявлялась в лизатах клеток, рекомбинантный штамм дрожжей не рос на d-галактуроновой кислоте. Дальнейшая адаптивная лабораторная эволюция в среде, содержащей как глицерин, так и d-галактуроновую кислоту, не привела к появлению мутантов, способных использовать d-галактуроновую кислоту.

Подобно Суффрио [10], мы выбрали восстановительный путь для введения в S.cerevisiae , поскольку предыдущие работы показали, что отдельные ферменты могут экспрессироваться в этих дрожжах [8, 15–17]. Однако наш подход отличается от подхода Суффрио [10] четырьмя способами: во-первых, мы интегрировали гены в геном дрожжей вместо использования плазмидных векторов; во-вторых, мы использовали гены T. reesei и A. niger ; в-третьих, мы также интегрировали транспортер d-галактуроновой кислоты [12]; и, в-четвертых, мы использовали d-фруктозу вместо глицерина в качестве вспомогательного субстрата для роста рекомбинантных дрожжей.Интересно, что и Суфрио [10], и мы обнаружили активность ферментов пути d-галактуроновой кислоты в клеточном лизате, но мы использовали гексозный сахар в качестве вспомогательного субстрата, а не глицерин, используемый Суффрио [10], а также Использование переносчика d-галактуроновой кислоты может быть причиной того, что мы смогли продемонстрировать потребление d-галактуроновой кислоты. Кроме того, использование d-галактуронатредуктазы A. niger GAAA, которая принимает как НАДН, так и НАДФН в качестве кофактора, вместо Т.Редуктаза reesei , которая строго использует только НАДФН, также могла способствовать наблюдаемому потреблению d-галактуроновой кислоты.

Хотя сконструированный штамм был способен катаболизировать d-галактуроновую кислоту, этот штамм все еще не оптимизирован для промышленных процессов с использованием богатых пектином отходов гидролизатов. В связи с тем, что грибковый путь требует снижения мощности, которая также необходима для производства этанола, дальнейшая разработка штамма и оптимизация условий культивирования все еще необходимы для устранения окислительно-восстановительного баланса этого процесса.

Заключение

В этой работе мы впервые описываем стратегию введения функционального пути, который приводит к катаболизму d-галактуроновой кислоты у Saccharomyces cerevisiae . Эта стратегия была основана на интеграции в дрожжевые хромосомы не только четырех ферментов грибкового пути катаболизма d-галактуроновой кислоты, но также недавно описанного переносчика d-галактуроновой кислоты. Это представляет собой первый шаг в создании штамма S.cerevisiae , которые могли бы производить этанол из d-галактуроновой кислоты. Такой штамм может найти применение на заводе по переработке отходов цитрусовых / сахарной свеклы, на котором богатые пектином отходы будут гидролизоваться, а затем ферментироваться для получения этанола.

Методы

Штаммы

Штамм S. cerevisiae CEN.PK111-61A был использован в качестве родительского штамма для созданных штаммов. Прототрофный CEN.PK113-1A использовали в качестве контроля при ферментации. Все плазмиды были произведены в E.coli TOP10 клеток. В таблице показаны исходные и сконструированные штаммы S. cerevisiae , использованные в данной работе.

Таблица 2

Штаммы, использованные в этой работе

Штаммы	Описание	Исходный штамм
Escherichia coli TOP10	E. coli для электропорации hsd R , mcr A , lac ZΔM15 , rec A
CEN.ПК111-61А	S. cerevisiae CEN.PK 111-61A MATα, ura 3-52, his 3-Δ1, leu 2-3112, TRP 1, MAL 28 ^c, SUC 2
CEN.PK113-1A	S. cerevisiae CEN.PK 113-1A MATα, URA 3, HIS 3, LEU 2, TRP 1, MAL 28 ^c, SUC 2
	С.cerevisiae ATCC	MAT α, his 3Δ 200, ura 3-52, leu 2 Δ 1 , lys 2-Δ 202, trp 1-Δ63
A. niger ATCC 1015	Матричная ДНК для гена gaa C
Schizosaccharomyces pombe	Матричная ДНК для гена his 5
h5362	С.cerevisiae CEN.PK 111-61A + gaaC (MATα, ura 3-52, HIS 5, лей 2-3112, TRP 1, MAL 28 ^c, SUC )	S. cerevisiae CEN.PK 111-61A
h5410	S. cerevisiae CEN.PK 111-61A + gaa C + gaa D (MATα, ura 3-52, HIS 5, LEU 2, TRP 1, MAL 28 ^c, SUC 2)	h5362
h5425	С.cerevisiae CEN.PK111-61A + gaa C + gaa D + gaa A (MATα, URA 3, HIS 5, LEU 2, TRP 1, TRP 1, TRP 1, TRP 1, c , SUC* 2)*	h5410
h5531	S. cerevisiae CEN.PK111-61A + gaa C + gaa D + gaa A + lgd 1 (MATα, URA 3, HIS 5, LEU TRP 2, LEU 1, MAL 28 ^c, SUC 2 , банка 1 ^-)	h5425
h5535	С.cerevisiae CEN.PK111-61A + gaa C + gaa D + gaa A + lgd 1 + gat 1- gfp (MATα, URA 3 3, LEU 2, TRP 1, MAL 28 ^c, SUC 2 , банка 1 ^- , HO ^-)	h5531

Среда и условия культивирования

Для размножения плазмид бактериальные штаммы культивировали в среде Luria Broth [18] с добавлением 100 мкг мл ампициллина ^-1 при 37 ° C. и 250 об. / мин.Для трансформации дрожжей использовали несколько сред. SCD: синтетическая полная среда с добавлением 20 г L ^-1 d-глюкозы [19]. SCD-URA: синтетическая полная среда с дефицитом урацила, дополненная 20 г L ^-1 d-глюкозы. SCD-HIS: синтетическая полная среда с дефицитом гистидина, дополненная 20 г L ^-1 d-глюкозы. SCD-LEU: полная синтетическая среда с дефицитом лейцина, дополненная 20 г L ^-1 d-глюкозы. SCD-URA / -HIS / -LEU: синтетическая полная среда с дефицитом урацила, гистидина и лейцина, дополненная 20 г L ^-1 d-глюкозы.YPD: 10 г L ^-1 дрожжевого экстракта, 20 г L ^-1 пептона, 20 г L ^-1 d-глюкозы [20]. YPD + G418: YPD с добавлением 200 мкг мл ^-1 генетицина. YPD + nourseothricin: YPD с добавлением 100 мкг / мл ^-1 nourseothricin.

Конструирование плазмид и интеграции поколений

Плазмиды перечислены в таблице. Праймеры, использованные для конструирования плазмид, перечислены в таблице. Все реакции ПЦР проводили с использованием Phusion High Fidelity (Finnzymes, Финляндия) и буфера Phusion High Fidelity или буфера для GC (Finnzymes, Финляндия).Вместо этого для ПЦР бактериальных и дрожжевых колоний использовали DyNAzyme (Finnzymes, Финляндия). Для ПЦР дрожжевых колоний разрушение клеток проводили с использованием зимолиазы 100 Т (Seikagaku Biobusiness, Япония). Лигирование проводили с использованием ДНК-лигазы Т4 (Promega, США). Рекомбинацию в дрожжах для сборки плазмиды или интеграции генома проводили с использованием набора для лабораторной трансформации (Molecular Research Reagents Inc., США), следуя протоколу Gietz et al. [21]. Рекомбинацию in vitro проводили с использованием Master Mix Gibson Assembly ^® (New England Biolabs, США).

Таблица 3

Плазмиды, использованные в этой работе

YY TPI 1 промоторная область, ампер ^R Bam Bam6 9056 g под промотором TPI B CAN 1 л ocus , KnM X и lgd 1 под PGK 1 промотор между Lox P сайтами и Sac lL и Kpn l сайтами рестрикции Вектор делеции, содержащий Cre , Amp ^R

Плазмида	Описание
B1181	YEplac195 с PGK 1 , промотор URA370 ^R
pRS426	Вектор интеграции дрожжей, URA 3 , Amp ^R
B5430	B1181 лигирован с gaa C.Содержит фрагмент 3 (PGK 1/ gaa C ) вектора интеграции gaa C между сайтами рестрикции bgl II
B5517	Вектор интеграции дрожжей, созданный гомологичной рекомбинацией. Содержит ген gaa C под промотором PGK 1, интеграцию локуса HIS 3 и маркер HIS 5 ( S. pombe ) между сайтами рестрикции Not I
B5470 pXY2 905 экспрессия гена gaa D под TPI 1 промотор
pRS405	Вектор интеграции дрожжей, LEU 2, Amp ^R
B5555	Дрожжевой вектор интеграции pRS405, экспрессирующий LEU 2 и gaa D под TPI 1 промотор между Afl B2388, содержащий сайты рестрикции
B5706	Плазмида Genescript pUC57, содержащая кодон-оптимизированный gaa A между Eco RI и Bam HI сайтами рестрикции
pRS406	Вектор интеграции дрожжей, содержащий URA 3, Amp ^R
B5697	Вектор интеграции дрожжей, содержащий URA 3 и gaa A под TPI 1 промотор между Afl II сайтов рестрикции

B6367	B2159, содержащий gat 1- gfp под TPI 1 промотор
B3531
B3531	Маркер интеграции 905 X37 KnM, содержащий 903 903 903 Маркер интеграции дрожжей
B6382	B3531 вектор интеграции дрожжей, содержащий gat 1- gfp под TPI 1 промотор

Таблица 4

Праймеры, использованные в этой работе

25 Праймеры Праймер Описание P1 ATGCCTTTTACCCCGCTCCG Для усиления gaa C от A.геном niger , для ПЦР колонии и секвенирования (прямой) P2 CTAAGCAATATCCGGCAACG Для амплификации gaa C из A. niger генома, для ПЦР колонии CGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCGTGAGGGTCAGTTATTTCAT Для получения фрагмента 1 (-1000 п.о. HIS 3 локус) амплификации от S.cerevisiae, (вперед) Р4 TATTTCTTTCTACAAAAGCCCTCCTACCCATCTTTGCCTTCGTTTATCTTG Для получения фрагмента 1 (-1000 п.о. HIS 3 локус) усиление от С.CEREVISIAE (обратный) Р5 TAACTCGAAAATTCTGCGTTCGTTAAAGCTAGCTGCAGCATACGATATAT Для получения фрагмента 4 (+1000 п.н. HIS 3 локус) амплификации от S.cerevisiae, (вперед) Р6 AAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCGGAGCCATAATGACAGCAGT Для получения фрагмента 4 (+1000 п.н. HIS 3 локуса) из S. cerevisiae (обратный) P7 AATGAGCAGGCAAGATAAACGAAGGCAAAGATGGGTAGGAGGGCTTTTGT 905 905 905 905 905 905 905pombae (вперед) Р8 TTCAGTTTTGGATAGATCAGTTAGAAAGCTATTAAGGGTTCTCGAGAGCT Для фрагмента 2 ( его 5) усиления от S. pombae (вперед) Р9 GGAAGATATGATCTACGTATGGTCATTTCTTC Для ТПИ 1 / gaa D-амплификация от B5470 (вперед) P10 GGAGATCTCGAATTGGAGCTAGAGAAAG Для TPI 1/ gaa D-амплификация от B5470 (обратная) TPI 9038 PTC и 905ATG 9038 9038 9038 секвенирование gaa D ORF (прямое) P12 TCGAATTGGAGCTAGACAAAG Для ПЦР колоний и секвенирования gaa D ORF (обратное) P13 90GCTG39 ATG P13 ORF (передний) 905 38 P14 CTACTTCAGCTCCCACTTTC Для ПЦР колоний и секвенирования gaa ORF (обратная) P15 CCTCGCACCCATGTACATTGG 905 905 905 905 905 905 905 9038 Для прямой ПЦР и секвенирования колоний 1705 TTATATTGGCCTTTATGTCCGC Для ПЦР колоний и секвенирования gat 1 ORF (обратная) P17 TATATACCCGGGGTGCCACCTGACGTCTAAGA
1 903 905 903 905 905 903 905 905 903 905 905 905 903 905 903 905 903 905 903 905 905 903 901 903 901 903 905 P18
TATATACCCGGGAGACCGAGATAGGGTTGAGT Для амплификации TPI1 / gat 1- gfp от B6367 (обратный)
705 gaaa интеграция с интеграцией gaaa gaaC интеграция с кассетой 70 Ген C под промотором PGK 1 (фрагмент 3), фланкирующий области с.cerevisiae HIS 3 (фрагменты 1 и 4), используемые в качестве гомологичных областей для интеграции генома, и ген S. pombe HIS 5 (дрожжевой маркер, фрагмент 2), собранный по кругу в векторе pRS426 (фрагмент 5), который содержит УРА 3 маркера.

gaa C был непосредственно амплифицирован из генома A. niger ATCC 1015. Его вставляли в промоторную область PGK 1 плазмиды B1181 с использованием сборки Гибсона. Полученная плазмида, B5430, содержит компонент PGK 1/ gaa C (фрагмент 3) интеграционной кассеты gaa C и была расщеплена Bgl II для получения фрагмента 3.Фрагмент 1, который соответствует нижележащей области длиной 1000 п.н. S. cerevisiae his 3, и фрагмент 4, который соответствует расположенной выше +1000 п.н. области his 3, были амплифицированы из S. cerevisiae ( h4488) геном. HIS 5 (фрагмент 2) был амплифицирован из генома S. pombae . Вектор pRS426 линеаризовали перевариванием Not I (вектор интеграции). Пять фрагментов интеграционной плазмиды gaa C были собраны путем рекомбинации в дрожжах.Маркер URA 3 использовали для отбора собранной плазмиды, и трансформанты отбирали в планшетах SCD-URA. Собранную плазмиду вводили в E.coli электропорацией для размножения и расщепляли Not I для выделения кассеты (фрагменты с 1 по 4). Интеграция кассеты gaa C в родительский штамм CEN.PK111-61A была выполнена путем рекомбинации. Маркер HIS 5 использовали для отбора дрожжей, интегрированных с gaa C, и трансформанты были отобраны в SCD-HIS и подтверждены с помощью ПЦР колоний.Активность подтверждали с использованием клеточного лизата. Колония, экспрессирующая га С, хранилась как h5362.

gaa D интеграция

gaa D амплифицировали из кДНК, рестриктировали Bgl II и лигировали с плазмидой B2159 в промоторной области TPI . gaa D под промотором TPI 1 амплифицировали и лигировали с вектором pRS405 (содержащим дрожжевой маркер LEU 2) с образованием вектора интеграции B5555.Кассета для интеграции gaa D с маркером LEU 2 была получена линеаризацией B5555 с использованием Afl II. Кассета gaa D была интегрирована в штамм дрожжей, экспрессирующий gaa C h5362, в локусе leu 2- 3112 . Трансформанты отбирали в SCD-LEU и подтверждали с помощью ПЦР колоний. Активность гена gaa D подтверждали с использованием клеточного лизата. Колония, экспрессирующая га C и га D, сохранялась как h5410.

gaa A интеграция

Ген gaa A был синтезирован на заказ как кодон-оптимизированная ORF (Genescript). Genescript gaa Плазмиду расщепляли Eco RI и Bam HI и лигировали с плазмидой B2159 в промоторной области TPI -1. Плазмида интеграции B5697 была получена путем лигирования фрагмента TPI 1/ gaa A с вектором pRS406 (B704), который содержит дрожжевой маркер URA 3.Кассета интеграции gaa A была получена линеаризацией B5697 с использованием Bsm I. Затем кассета была интегрирована в локус ura 3- 52 штамма дрожжей h5410 ( gaa C + gaa D). Трансформанты отбирали в среде SCD-URA и подтверждали с помощью ПЦР колоний. Активность подтверждали с использованием клеточного лизата. Колония, экспрессирующая га C, га D и га A, хранилась как h5425.

lgd 1 интеграция

Интеграционная плазмида B3013, несущая готовый для интеграции в дрожжи ген lgd 1, была доступна из предыдущей работы [22].Эта интеграционная кассета состоит из двух фланкирующих областей для CAN 1, гена lgd 1 под промотором PGK 1 и дрожжевого маркера Kan MX (устойчивость к G418) между двумя сайтами lox P. Плазмиду расщепляли с помощью Sac I и Kpn I, и интегрирующую кассету трансформировали в дрожжевой штамм h5425 ( gaa A + gaa C + gaa D). Перед посевом дрожжевые клетки инкубировали в 2 мл SCD в течение 1 часа.Трансформанты были отобраны в YPD + G418 и подтверждены анализом активности клеточного лизата lgd 11. Затем был удален маркер Kan MX путем трансформации выбранной дрожжевой колонии плазмидой pSH66, экспрессирующей рекомбиназу cre , которая удаляет дрожжевой маркер Kan MX между сайтами lox P [23]. Перед посевом в YPD + nourseothricin дрожжевые клетки инкубировали в 2 мл SCD в течение 1 часа. Через 4 дня полученные колонии повторно высевали в YPD + nourseothricin.Биомассу из этого планшета инокулировали в 50 мл YP + 2% галактозы и инкубировали в течение ночи. Полученную культуру высевали в YPD. Некоторые изолированные колонии повторно высевали в чашки с G418 и среду SCD-URA / -LEU / -HIS. Через 2 дня ни одна из колоний не росла на G418, подтверждая, что маркер Kan MX был удален. Колония, экспрессирующая gaa C, gaa D, gaa A и lgd 1, сохранялась как h5531.

gat 1-gfp интеграция

Ген gat 1- gfp был синтезирован на основе работы Benz [12] как кодон-оптимизированная ORF (Genescript) gat 1- Фрагмент gfp расщепляли из плазмиды Genescript и лигировали с плазмидой B2159 в промоторной области TPI 11.Для интеграционной кассеты фрагмент TPI 1/ gat 1- gfp расщепляли Xma I. Вектор B3531, который содержит область интеграции HO и дрожжевой маркер Kan MX, расщепляли Cfr. 9I и лигировали с фрагментом TPI 1/ gat 1- gfp . Кассету интеграции gat 1- gfp получали путем расщепления интеграционной плазмиды с Xho I и Xba I и трансформировали в штамм h5531.Клетки дрожжей инкубировали в 2 мл YPD в течение 2 ч, а затем высевали в планшеты YPD + G418. Для подтверждения интеграции гена gat 1- gfp клетки инкубировали в среде SCD в течение 24 часов и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Колонию, показывающую зеленую флуоресценцию (от репортерного гена gfp ), хранили как h5535.

Ферментативные анализы

Экстракты клеток, полученные следующим образом, использовали во всех ферментативных анализах. Дрожжевые клетки выращивали в среде YPD и собирали центрифугированием, промывали водой и ресуспендировали в фосфатном буфере 50 мМ, pH 7 с добавлением ингибитора протеаз Complete EDTA Free (Roche, Швейцария).Клетки разрушали стеклянными шариками диаметром 0,4 мм с использованием миксера FastPrep (MP Biomedicals, США) и твердые остатки удаляли центрифугированием. Содержание белка определяли по методу Брэдфорда [24].

Активность

d-галактуронатредуктазы (GAAA) и l-глицеральдегидредуктазы (GAAD) определяли в прямом направлении по уменьшению поглощения при 340 нм, вызванному окислением NADPH. Реакционная среда для d-галактуронатредуктазы содержала 10 мМ d-галактуроновой кислоты (Sigma-Aldrich, Германия) и 0.2 мМ НАДФН (Sigma-Aldrich, Германия). Реакционная среда для l-глицеральдегидредуктазы содержала 5 мМ l-глицеральдегида (Sigma-Aldrich, Германия) и 0,2 мМ NADPH (Sigma-Aldrich, Германия). За реакциями d-галактуронатредуктазы и l-глицеральдегидредуктазы следили в течение 5 мин.

Активность

l-галактонатдегидратазы (LGD1) и 2-кето-3-дезоксигалактонатальдолазы (GAAC) опосредованно определяли путем измерения поглощения при 549 нм, что соответствует хромогенному соединению, которое образуется при соединении тиобарбитуровой кислоты с 2-кето -3-дезоксигалактуронат [25].Реакционная среда для l-галактонатдегидратазы содержала 10 мМ l-галактоновой кислоты (получена гидролизом l-галактоно-1,4-лактона, Sigma-Aldrich, Германия) и продолжалась в течение 2 часов. Реакционная среда для 2-кето-3-дезоксигалактонатальдолазы содержала 10 мМ l-глицеральдегида (Sigma-Aldrich, Германия) и 10 мМ пирувата (Sigma-Aldrich, Германия) и продолжалась в течение 30 мин. l-Галактонатдегидратазу анализировали в прямом направлении. 2-кето-3-дезоксигалактонатальдолазу анализировали в обратном направлении, поскольку ее субстрат, 2-кето-3-дезоксигалактуронат, коммерчески недоступен.

Испытания ферментации

В адаптивной лабораторной эволюции трансформированных дрожжей использовалась среда YP (10 г л ^-1 дрожжевой экстракт, 20 г л ^-1 пептона) pH 4,5, с добавлением 12 г L ^-1 d-галактуроновая кислота. Для анализа потребления d-галактуроновой кислоты трансформированными дрожжами при коферментации с d-фруктозой использовалась среда YP pH 7 с добавлением 5 г L ^-1 d-галактуроновой кислоты и 80 г L ^-1 d-фруктозы .Для оценки роли d-фруктозы в катаболизме d-галактуроновой кислоты первоначально использовалась среда YP pH 7 с добавлением 5 г L ^-1 d-галактуроновой кислоты и 40 г L ^-1 d-фруктозы. Через 72 часа добавляли концентрированный раствор d-фруктозы (40% мас. / Об.), Чтобы получить концентрацию примерно 40 г L ^-1 d-фруктозы. В экспериментах по отслеживанию ¹³ C d- [UL- ¹³ C ₆] галактуронат калия (Omicron Biochemicals, Inc., США) был использован для отслеживания судьбы d-галактуроновой кислоты. Эксперимент проводили с 2 г L ^-1 меченой d-галактуроновой кислоты, 2 г L ^-1 немеченой d-галактуроновой кислоты и 40 г L ^-1 d-фруктозы в YP. среда (нейтральный pH). Образцы супернатанта отбирали с 12-часовыми интервалами времени, а биомассу собирали через 96 часов ферментации. Все ферментации проводили в аэробных условиях при 250 об / мин и температуре 30 ° C. Штамм CEN.PK 113-1A, не содержащий пути или переносчика, и с аналогичным генетическим фоном, использовали в качестве контроля во всех экспериментах.

Адаптивная лабораторная эволюция

Адаптивная лабораторная эволюция - это метод, направленный на отбор микроорганизмов, более приспособленных для роста в среде определенного типа, например среды, содержащей токсичные соединения или неметаболизируемые сахара [26]. В этой работе адаптивная лабораторная эволюция использовалась для отбора мутантов, более подходящих для выращивания с d-галактуроновой кислотой в качестве источника углерода. Это исследование было проведено со штаммами h5531 и h5535, оба из которых несут восстановительный путь грибков, при этом h5535 также содержит ген-переносчик.Культивирование проводили в среде YP pH 4,5 с добавлением 12 г L ^-1 d-галактуроновой кислоты. Разведение 1:50 в свежей среде производилось каждые 7 дней. Культивирование продолжалось в течение 8 недель и было проанализировано с помощью ВЭЖХ, как описано ниже.

Химический анализ

Образцы жидкого ферментационного бульона отбирали с интервалами 12-48 часов или 7 дней (адаптивная лабораторная эволюция). Концентрации d-галактуроновой кислоты, d-фруктозы и этанола определяли с помощью ВЭЖХ с использованием колонки для быстрого кислотного анализа (100 мм × 7.8 мм, BioRad Laboratories, Калифорния, США), соединенный с колонкой для анализа органических кислот Aminex HPX-87H (300 мм × 7,8 мм, BioRad Laboratories) и 5 мМ H ₂ SO ₄ в качестве элюента со скоростью потока 0,5 мл мин ⁻¹. Колонку поддерживали при 55 ° C. Пики детектировали с использованием дифференциального рефрактометра Waters 410 и двухволнового УФ-детектора Waters 2487 (210 нм).

ЯМР-анализ

ЯМР-эксперименты проводили либо при 22 ° C (культуральные супернатанты), либо при 40 ° C (гидролизат биомассы) на ЯМР-спектрометре Bruker Avance III 600 МГц, оборудованном криозондом QCI.Образцы культурального супернатанта готовили смешиванием 540 мкл супернатанта с 60 мкл D ₂ O (Aldrich, Германия). Гидролиз биомассы HCl, а также эксперименты ¹ H, ¹³ C HSQC алифатической области с высоким разрешением ¹³ C подробно описаны Jouhten и Maaheimo [27]. Для развязки ¹³ C во время сбора данных использовался GARP4.

Вклад авторов

AB, JK, HM и PR разработали и разработали эксперименты.AB, MS-G, JK, HM и PR провели экспериментальную работу и проанализировали данные. AB, JK, HM, DM и PR написали и отредактировали статью. NK, DM и PR разработали фундаментальную концепцию и участвовали в координации исследования. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Благодарности

Благодарим коллектив VTT за техническую поддержку.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Наличие данных и материалов

Набор данных, подтверждающий выводы этой статьи, включен в качестве Дополнительного файла 1.

Утверждение этических норм и согласие на публикацию

Не применимо.

Финансирование

Это исследование было поддержано Академией Финляндии в рамках программы устойчивой энергетики (грант 271025), а также CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), бразильским правительственным агентством по развитию науки и технологий. Исследовательские стипендии были предоставлены CNPq Дэвиду Митчеллу, Мауре Сугаи-Гериос и Надии Кригер, а CNPq (PDE 207321 / 2015-9) и CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) - Алессандре Биз. развитие кадров в высшей школе.Финансирующий орган не участвовал в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Список литературы

2. FAOSTAT. Объемы производства по странам. Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций, Статистический отдел. 2013. http://faostat3.fao.org/browse/Q/QC/E. По состоянию на 28 июня 2016 г. 3. Громан К., Камерон Р., Ким И., Видмер В., Лусио Г. Экстракция и извлечение пектиновых фрагментов из отходов переработки цитрусовых для совместного производства с этанолом.J Chem Technol Biotechnol. 2013; 88: 395–407. DOI: 10.1002 / jctb.3859. [CrossRef] [Google Scholar] 4. Эдвардс М.С., Доран-Петерсон Дж. Биомасса, богатая пектином, в качестве сырья для производства топливного этанола. Appl Microbiol Biotechnol. 2012; 95: 565–575. DOI: 10.1007 / s00253-012-4173-2. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Лохрасби М., Пурбафрани С., Никлассон С., Тахерзаде М.Дж. Разработка технологического процесса и экономический анализ завода по переработке цитрусовых отходов с использованием биотоплива и лимонена в качестве продуктов. Биоресур Технол.2010; 101: 7382–7388. DOI: 10.1016 / j.biortech.2010.04.078. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Громанн К., Болдуин Э.А. Гидролиз апельсиновой корки ферментами пектиназой и целлюлазой. Biotechnol Lett. 1992; 14: 1169–1174. DOI: 10.1007 / BF01027023. [CrossRef] [Google Scholar] 7. Phatak L, Chang KC, Brown G. Выделение и характеристика пектина в жоме сахарной свеклы. J Food Sci. 2006; 53: 830–833. DOI: 10.1111 / j.1365-2621.1988.tb08964.x. [CrossRef] [Google Scholar] 8. ван Марис AJ, Abbott DA, Bellissimi E, van den Brink J, Kuyper M, Luttik MA, Wisselink HW, Scheffers WA, van Dijken JP, Pronk JT.Алкогольная ферментация источников углерода в гидролизатах биомассы с помощью Saccharomyces cerevisiae : текущее состояние. Антони Ван Левенгук J Microb. 2006; 90: 391–418. DOI: 10.1007 / s10482-006-9085-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Хуэйс Э. Х., Луттик М. А., Альмеринг М. Дж., Бисшопс М. М., Данг Д. Х., Клееребезем М., Сизен Р., ван Марис А. Дж., Пронк Дж. Т.. На пути к ферментации пектина с помощью Saccharomyces cerevisiae : экспрессия первых двух этапов бактериального пути метаболизма d-галактуроната.J Biotechnol. 2012; 162: 303–310. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2012.10.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Суффрио Б. Транспорт и метаболизм d-галактуроновой кислоты в дрожжах Saccharomyces cerevisiae . Докторская диссертация. Katholieke Universiteit Leuven, Бельгия, 2012. [PubMed] 11. Motter FA, Kuivanen J, Keränen H, Hilditch S, Penttilä M, Richard P. Классификация дегидратаз сахарных кислот в Aspergillus niger . Fungal Genet Biol. 2014; 64: 67–72. DOI: 10.1016 / j.fgb.2013.12.006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Бенц Дж. П., Процко Р. Дж., Андрич М. С., Бауэр С., Дуэбер Дж. П., Сомервиль Р. Идентификация и характеристика переносчика галактуроновой кислоты из Neurospora crassa и его применение для процессов ферментации Saccharomyces cerevisiae . Биотехнология Биотопливо. 2014; 7:20. DOI: 10.1186 / 1754-6834-7-20. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Суффрио Б., Абт Т., Тевелейн Дж. М.. Доказательства быстрого поглощения d-галактуроновой кислоты дрожжами Saccharomyces cerevisiae транспортной системой канального типа.FEBS Lett. 2012; 586: 2494–2499. DOI: 10.1016 / j.febslet.2012.06.012. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Hilditch S, Berghäll S, Kalkkinen N, Penttilä M, Richard P. Недостающее звено в пути грибкового d-галактуроната: идентификация l-трео-3-дезоксигексулосонат альдолазы. J Biol Chem. 2007. 282: 26195–26201. DOI: 10.1074 / jbc.M704401200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Мартенс-Узунова ES, Schaap PJ. Эволюционно консервативный метаболический путь d-галактуроновой кислоты действует через мицелиальные грибы, способные к деградации пектина.Fungal Genet Biol. 2008. 45: 1449–1457. DOI: 10.1016 / j.fgb.2008.08.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Ричард П., Хилдич С. Катаболизм d-галактуроновой кислоты в микроорганизмах и его биотехнологическое значение. Appl Microbiol Biotechnol. 2009; 82: 597–604. DOI: 10.1007 / s00253-009-1870-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Лиепинс Дж., Куорелахти С., Пенттила М., Ричард П. Ферменты для НАДФН-зависимого восстановления дигидроксиацетона и d- и l-глицеральдегида в плесени Hypocrea jecorina .FEBS J. 2006; 273: 4229–4235. DOI: 10.1111 / j.1742-4658.2006.05423.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Sambrook J, Fritch EF, Maniatis T. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. Нью-Йорк: Лаборатория издательства Колд-Спринг-Харбор; 1989. [Google Scholar] 19. Адамс А., Готчлинг Д.Е., Кайзер К.А., Стернс Э. Методы в генетике дрожжей: руководство по лабораторному курсу. Нью-Йорк: издательство лаборатории Колд-Спринг-Харбор; 1997. [Google Scholar] 20. Осубель FM, Брент Р., Кингстон Р. Э., Мур Д. Д., Зайдман Дж. Г., Смит Дж. А., Штрул К.Текущие протоколы в молекулярной биологии. Нью-Йорк: Уайли; 1994. [Google Scholar] 21. Гитц Р. Д., Вудс Р. А.. Трансформация дрожжей методом ацетата лития / одноцепочечной ДНК-носителя / ПЭГ. Метод Microbiol. 1998. 20: 53–66. DOI: 10.1016 / S0580-9517 (08) 70325-8. [CrossRef] [Google Scholar] 22. Kuorelahti S, Jouhten P, Maaheimo H, Penttilä M, Richard P. l-галактонатдегидратаза является частью грибкового пути катаболизма d-галактуроновой кислоты. Mol Microbiol. 2006. 61: 1060–1068. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2006.05294.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Hegemann JH, Heick SB. Удалить и повторить: комплексный инструментарий для последовательного нокаута гена в почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Методы Мол биол. 2011; 765: 189–206. DOI: 10.1007 / 978-1-61779-197-0_12. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Брэдфорд ММ. Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель. Анальная биохимия. 1976; 72: 248–254. DOI: 10.1016 / 0003-2697 (76)-3.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Бьюкенен С.Л., Коннарис Х., Дэнсон М.Дж., Рив К.Д., Хаф Д.В. Чрезвычайно термостабильная альдолаза из Sulfolobus solfataricus со специфичностью к нефосфорилированным субстратам. Биохим Дж. 1999; 343: 563–570. DOI: 10,1042 / bj3430563. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Винклер Дж., Рейес Л.Х., Као К.С. Адаптивная лабораторная эволюция для инженерии деформации. Методы Мол биол. 2013; 985: 211–222. DOI: 10.1007 / 978-1-62703-299-5_11. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27.Jouhten P, Maaheimo H. Анализ мечения для ¹³ C MFA с использованием ЯМР-спектроскопии. В: Nielsen LK, Blank LM, Krömer JO, редакторы. Анализ метаболического потока. Методы и протоколы. Нью-Йорк: Humana Press; 2014. С. 143–164. [PubMed] [Google Scholar]

Фенотипическая и молекулярная эволюция на протяжении 10 000 поколений в популяциях лабораторных почкующихся дрожжей

Рецензент № 1:
[…] Одно из основных отличий от эксперимента LTE на E. coli - это размер популяций.Объяснило бы это некоторые из наблюдаемых различий? Я считаю, что здесь нужно еще немного обсудить.

Наши популяции значительно меньше, чем популяции LTEE, и это, безусловно, может быть одной из причин, по которой мы не видим такого длительного сосуществования, как в LTEE. Мы добавили предложение в Обсуждение по этому поводу:

«С другой стороны, сосуществующие линии могли появиться в нашем эксперименте, но были потеряны из-за сильной адаптации или дрейфа внутри линии. Поскольку наши популяции меньше, чем в LTEE, низкочастотные клоны чаще всего теряются во время ежедневных узких мест.”

И мы добавили предложение к материалам и методам детализации численности населения:

«Эти разведения определяют количество удвоений или поколений в день (10 для YPD 30 ° C и SC 30 ° C, 8 для SC 37 ° C), размер популяции узких мест (~ 8 • 10 ³ для YPD 30 ° C и SC 37 ° C, ~ 2 • 10 ³ для SC 30 ° C) и соответствующий эффективный размер популяции (~ 6 • 10 ⁴ для YPD 30 ° C, ~ 4 • 10 ⁴ для SC 37 ° C, ~ 1 • 10 ⁴ для SC 30 ° C) (Wahl and Gerrish, 2001).Эти размеры узких мест основаны на оценочных плотностях насыщения ~ 6 • 10 ⁷ для YPD и ~ 1,6 • 10 ⁷ для SC в 96-луночных планшетах, измеренных с помощью счетчика Coulter Counter Z2 (Beckman Coulter) ».

Различная адаптивная динамика и паттерны гаплоидов и диплоидов - это, пожалуй, самая интересная и самая новая часть исследования, и я считаю, что она заслуживает большего внимания в разделе «Обсуждение». Авторы внимательно рассматривают различные возможные причины более медленной адаптации, наблюдаемой у диплоидов, а также потенциальную роль LOH и пола (включая инбридинг).Идея о том, что инбридинг может помочь избавиться от вредных гетерозиготных мутаций автостопщиков, особенно интересен и может даже объяснить, почему дрожжевые клетки развили систему переключения типа спаривания, которая способствует инбридингу (помимо того факта, что она также облегчает клеткам выход из гаплоидной формы после событие спороношения, которое может иметь решающее значение для выживания в условиях голода и других стрессовых условиях). Интересно, могут ли авторы еще немного прокомментировать эти аспекты. Более того, быстрая и вероятная необратимая потеря способности проходить половой цикл может также сказать нам, что лабораторные эксперименты по эволюции очень далеки от эволюции в природе, поскольку большинство диких штаммов демонстрируют эффективный мейоз.С другой стороны, одомашненные промышленные дрожжи демонстрируют очень похожие модели эволюции, что предполагает, что одомашнивание промышленных микробов на самом деле очень похоже на эксперименты по направленной эволюции, проводимые в лабораториях (например, собственная работа моей лаборатории: DOI: https: // doi .org / 10.1016 / j.cell.2016.08.020)

Спасибо, что обратили на это наше внимание. Особенно интересно подумать о том, может ли накопление вредных рецессивных мутаций в течение периода бесполой (или в основном бесполой) эволюции у этих одомашненных штаммов привести к низкой жизнеспособности спор, а затем к ослаблению отбора по фенотипам, необходимым для полового цикла.Конечно, это немного проблема курицы или яйца! Было бы интересно посмотреть, отличаются ли признаки потери гетерозиготности у этих промышленных штаммов, которые кажутся полностью бесполыми, хотя мы не уверены, в какой степени можно отличить LOH от рекомбинации от спаривания в этих случаях. Для целей данной статьи мы добавили строку в параграф «Результаты», где обсуждаем это явление, чтобы привлечь внимание к этой связи с одомашниванием (новый текст подчеркнут):

«Таким образом, прохождение через сито Холдейна путем потери гетерозиготности должно стать менее вероятным, поскольку популяции накапливают значительный груз автостопных гетерозиготных мутаций.[…] Однако мы отмечаем, что в половых линиях рекомбинация с достаточным инбридингом может резко изменить эту динамику, постоянно очищая рецессивную вредную нагрузку (Charlesworth and Willis, 2009) ».

Обсуждение: Рост мутаторных фенотипов может также зависеть от уровней и природы селективного давления, оказываемого на клетки? Условия, которые серьезно затрудняют рост (и, следовательно, появление мутаций), или стрессовые условия, требующие комбинированного воздействия двух (или более) мутаций, могут быть более склонны к эволюционному успеху мутаторов? См., Например, DOI: 10.7554 / eLife.22939.

Мы согласны с тем, что различия в окружающей среде и наследственные генотипы могут способствовать изменениям в распределении эффектов приспособленности, которые могут изменить косвенный отбор для мутаторов. Мы добавили скобку к предложению, в котором мы обсуждаем это, чтобы особо выделить потенциальную роль условий окружающей среды или различий в наследственной пригодности, с цитатами из примеров:

«Напротив, отсутствие мутаторных клонов может происходить из-за разницы в скорости возникновения мутаторов или разного баланса между относительной важностью полезных и вредных мутаций (который зависит от окружающей среды и родовой пригодности; см. E.г. Swings et al., 2017 и Kryazhimskiy et al., 2014), что приводит к меньшему косвенному отбору мутаторов (Good and Desai, 2016) ».

Рецензент № 2:
[…] Рукопись в целом написана хорошо, и я считаю, что она заслуживает серьезной публикации с широким кругом читателей. Несколько более крупных предложений предназначены для более тщательного обсуждения следующих моментов:
1) Одна из самых больших загадок в моей голове - это то, почему авторы не видели большей полиплоидизации. Как отмечают Harari et al., 2018, и было обнаружено во многих предыдущих длительных экспериментах (начиная с Gerstein et al., 2006 и многих других, отмеченных в таблице 1 Fisher et al., 2018), спонтанная диплоидизация является обычным явлением в экспериментальных исследованиях эволюции дрожжей. Учитывая, что у диплоидов было такое большое начальное преимущество приспособляемости (рис. 2), интересен тот факт, что только одна линия диплоидизировалась за гораздо более длительный промежуток времени. Является ли это чем-то особенным для штамма или условий окружающей среды (я не видел ничего, что могло бы выборочно поддерживать гаплоиды в Материалах и методах, хотя линии были сконструированы так, чтобы иметь возможность выборочно поддерживать гаплоиды по сравнению с диплоидами).Harari et al. изучили несколько штаммов, поэтому не очевидно, что используемый здесь штамм, производный от W303, будет отличаться.

Первое, что мы сделали, когда начали собирать эти данные, было предварительное окрашивание плоидности, и мы также были удивлены, обнаружив низкие уровни полиплоидизации. Хотя существует множество возможных объяснений, связанных с различиями в давлении отбора между гаплоидами и диплоидами, мы полагаем, что это во многом связано с более низкой скоростью эндоредупликации в наших штаммах. В отличие от Фишера и др., 2018, мы обнаружили, что автодиплоидизация у наших штаммов W303 встречается довольно редко. Причина этого несоответствия остается для нас в некоторой степени загадкой, но у нас есть документ в стадии подготовки, определяющий генетическую основу этого различия между W303 и другими штаммами. Анализ данных для этой статьи все еще продолжается, но мы добавили предложение, чтобы более точно отразить, насколько удивительным был этот результат, со ссылкой на другие предыдущие работы:

«Мы были удивлены этим результатом; предыдущие исследования показали, что эволюционирующие популяции гаплоидных дрожжей часто становятся диплоидными (Gerstein et al., 2006; Фишер и др., 2018; Харари, 2018) ».

2) Главный результат - уменьшение прироста физической формы. Это, конечно, не удивительно, и я верю результату, но я был удивлен, что это не было решено количественно. Один из самых больших вопросов, который решает LTEE, заключается в том, приближается ли приспособленность к асимптоте или продолжает расти медленными темпами. Почти наверняка еще слишком рано рассматривать этот вопрос окончательно, но установка различных функций и указание того, что можно или нельзя отклонить на данном этапе, было бы желанным дополнением к статье.

Мы ценим этот момент и соглашаемся, что он должен стать частью будущего анализа, когда пройдут еще несколько поколений и будут завершены более плотные во времени тесты приспособленности (возможно, на меньшем наборе популяций). К сожалению, мы не думаем, что наши текущие данные не подходят для такого анализа. У нас есть временные разреженные измерения приспособленности во второй половине эволюции по сравнению с Wiser et al., 2013, и мы наблюдаем некоторые эффекты пакетного анализа пригодности (обсуждаемые в материалах и методах), которые, хотя и незначительны по общему масштабу приспособленности, изменяются за В ходе эксперимента может иметь существенное (и ложное) влияние на такую подгонку модели.

3) Аналогичным образом утверждается, что изменчивость между линиями уменьшается (подраздел «Пригодность изменяется в процессе эволюции»), но это не является ни статистически подтвержденным, ни визуально очевидным на Рисунке 2.

Спасибо, что обратили на это наше внимание - при более тщательном анализе это не всегда верно в нашем эксперименте: вариабельность между всеми развивающимися популяциями действительно уменьшается при YPD 30 ° C и SC 37 ° C, но увеличивается при SC 30 ° C. , управляемый диплоидами с низкой пригодностью и линиями реверсии ade2-1 с высокой приспособленностью.Мы удалили это предложение.

4) Обсуждая отсутствие мутаторов, возможно, также обратите внимание на разницу в частоте наследственных мутаций. S. cerevisiae имеет более высокую частоту мутаций по всему геному, чем E. coli (Lynch et al., 2016), что уменьшило бы преимущество перед редкими мутаторами.

Спасибо, что подняли этот вопрос - нам кажется вероятным, что это могло быть одной из причин отсутствия мутаторов, и оно отсутствовало в Обсуждении.Мы добавили это предложение в Обсуждение:

«У нас также может быть меньше второго порядка отбора мутаторов в нашем эксперименте, потому что у наших штаммов частота мутаций выше, чем у предкового штамма E. coli в LTEE, но ниже, чем у линий мутаторов LTEE (Lang and Murray, 2008; Wielgoss et al., 2013) ».

5) Другим важным отличием от LTEE является отсутствие сосуществующих штаммов. Не уверен, что это качественная разница.Сосуществование возможно только после того, как закончился период сильно адаптивных движений (то есть, когда польза приспособленности от любой адаптивной мутации падает ниже разницы приспособленности между сосуществующими штаммами). Учитывая явные признаки адаптивных мутаций, показанные на рисунке 3 (включая добавку), вполне может быть, что существует множество мутаций, которые могут сосуществовать, но автостоп устранил их. Только после того, как улучшение физической формы действительно замедлилось, можно было увидеть, как они сохраняются.

Мы ценим этот момент и думаем, что он связан с комментарием другого рецензента о различиях в размере популяции между нашими популяциями и популяциями LTEE.Мутации, распространяющиеся внутри сосуществующих линий, могут сместить равновесную частоту в низкую / высокую частоту, так что одна линия легко теряется из-за дрейфа в узком месте. Мы не уверены, насколько этот эффект зависит от стадии адаптации, хотя, как вы заметили, мы наивно ожидали, что он будет наиболее сильным на ранних этапах эволюции; однако, оглядываясь назад на сосуществующие клоны, описанные в Good et al., 2017, сосуществующие клоны изменяют равновесную частоту на большие количества даже на поздних этапах LTEE. В любом случае мы согласны с тем, что возможность того, что адаптация внутри линии вызвала устранение сосуществующих линий, является важным моментом, который упускался из нашего Обсуждения.Мы добавили это предложение в Обсуждение и указали приблизительные размеры населения в Материалах и методах (см. Первый комментарий рецензента 1 выше):

«С другой стороны, сосуществующие линии могли появиться в нашем эксперименте, но были потеряны из-за дрейфа или сильной адаптации внутри линии. Поскольку наши популяции меньше, чем в LTEE, низкочастотные клоны будут чаще теряться во время ежедневных узких мест ».

6) В Обсуждении утверждается, что авторы находят только «один сильный случай повторяемости на уровне замены нуклеотидов», но это фактически не обсуждалось в тексте.О каком случае они имеют в виду? Их несколько перечислено на рис. 5 - приложение к рисунку 1. Кроме того, читатель не может сказать, является ли загрязнение возможным источником повторных попаданий на этом дополнительном рисунке. Пожалуйста, обсудите.

Здесь мы имеем в виду реверсии ade2-1 , на которые мы сейчас прямо ссылаемся в тексте, и мы также пояснили, что это единственный убедительный случай повторного выбора на уровне изменения нуклеотидов, поскольку другие изменения, перечисленные на рисунке 5 - добавление к рисунку 1, вероятно, являются результатом частых мутаций в повторяющихся областях или (в одном случае) случайностью (обратите внимание, что рисунок 5 - приложение 1 теперь включено в дополнительный файл 4, потому что eLife делает не допускать таблиц в качестве дополнений к рисункам).Теперь текст гласит:

«Мы находим только один убедительный случай повторяемого отбора на уровне замены нуклеотидов ( ade2-1 реверсий)».

Доказательство того, что эти мутации не являются результатом перекрестного заражения, содержится в данных по частоте аллелей: каждая популяция имеет уникальные мутации, которые фиксируются в начале эксперимента и остаются неизменными на протяжении всего эксперимента. Мы также исследовали все эти случаи индивидуально в интерактивном браузере данных, чтобы убедиться, что они не являются ошибками выравнивания или артефактами загрязнения последовательности.

Другие комментарии:
1) Первая страница Введения слишком общая и может быть сокращена или сокращена.

Мы ценим этот отзыв, но решили оставить Введение в его широком формате в этой редакции, которая, как мы надеемся, будет интересна читателям, не знакомым непосредственно с данной областью.

2) Утверждение, сделанное в тексте, что «Мы находим другую закономерность в некоторых диплоидных популяциях, где начальный более медленный период улучшения приспособленности сменяется значительным быстрым увеличением приспособленности», не подтверждается представленными данными.Я бы переместил Рисунок 2 - дополнение к рисунку 1B на Рисунок 2 в качестве второго ряда панелей. Даже тогда, как показано на этих дополнительных панелях, диплоиды, по-видимому, быстро адаптируются только позже в SC30; это могло быть из-за разделения курса на половинки эксперимента на Рисунке 2 - добавление к рисунку 1B (будут ли трети яснее?), но в любом случае необходимо добавить статистические доказательства этого утверждения.

Мы согласны с тем, что это было слишком широко сформулировано, без убедительных доказательств того, что это систематический образец.Мы внесли поправку в предложение, чтобы оно читалось как «некоторые диплоидные популяции в SC 30 ° C», и вырезали следующее предложение о диплоидных популяциях, «догоняющих» во второй половине эволюции. Мы ценим предложение перенести рисунок 2 - дополнение к рисунку 1B к основному рисунку, но решили сохранить только необработанные данные о пригодности на рисунке 2, потому что мы считаем, что основной смысл рисунка 2 - приложение 1 (чтобы показать снижение адаптивности) является качественно ясно в существующих панелях рисунка 2.

3) В связи с вышеизложенным, одно из основных объяснений того, почему ожидается ускорение диплоидной адаптации, заключается в том, что доступные полезные мутации являются частично рецессивными, что дает небольшой импульс при гетерозиготах, но только значительное повышение приспособленности после LOH событие происходит.Это интересно, но для этого необходимо статистически показать, что есть ускорение прироста приспособленности диплоидов, что не ясно.

Мы согласны с тем, что этот эффект может играть важную роль. Наше лучшее предположение состоит в том, что либо этот эффект, либо связанный с ним эффект, при котором полезные мутации полностью рецессивны и популяции должны ждать событий LOH, чтобы отбор вообще воздействовал на эти мутации, отвечает за быстрое увеличение приспособленности диплоидных популяций в SC 30. ° C позже в эксперименте.Как вы говорите, однако, чтобы продемонстрировать эти эффекты, нам необходимо продемонстрировать ускорение прироста физической формы в этих популяциях, в идеале одновременно с мероприятиями LOH. Хотя мы можем случайно найти случаи, в которых значительное увеличение приспособленности диплоидных популяций при SC 30 ° C происходит одновременно с гомозиготной фиксацией мутаций в пути ADE (самый простой способ увидеть это - использовать интерактивный браузер данных, расположенный по адресу https: // www.miloswebsite.com/exp_evo_browser), у нас нет статистических данных, чтобы продемонстрировать, что эти случаи ответственны за общие закономерности прироста физической формы.

4) Введение и подраздел «Паттерны молекулярной эволюции, характерные для диплоидов» - Прямое сравнение гаплоидной и диплоидной скоростей адаптации было проведено Герштейном и др., 2011 г. [Можно сослаться на эксперимент Марада, но гаплоидный и диплоидный эксперименты не проводились одновременно и только в одной среде. Фишер и др. Эксперимент на самом деле не так важен для этого момента, но очень важен для путей адаптации, доступных для гаплоидов по сравнению с диплоидами, и разницы в скорости автодиплоидизации.]

Спасибо, что обратили на это наше внимание! Мы добавили цитаты из Gerstein et al. 2011, на нескольких сайтах в тексте и согласны с тем, что это гораздо более полная и убедительная демонстрация различий в скорости адаптации между гаплоидами и диплоидами.

5) «Согласие с этой гипотезой» - открытие медленной, а затем быстрой адаптации не согласуется с гипотезой в предыдущем предложении о том, что диплоиды адаптировались медленнее, потому что они начали с более высокой приспособленности.Эта гипотеза не объясняет, почему диплоиды ускоряются.

Да, вы правы! Первоначально мы включили эту мысль, так как наблюдение диплоидов, адаптирующихся быстрее, чем гаплоидов, во второй половине эксперимента в этой среде казалось поразительным и отличалось от предыдущих результатов, но при более тщательном рассмотрении этот эффект, вероятно, связан с тем, что некоторые из эти диплоидные популяции не имеют мутации пути ADE, зафиксированной в начале второй половины эволюции, а это означает, что повышенная скорость адаптации диплоидов, вероятно, связана с различием между генотипами, гаплоидные и диплоидные популяции начинают вторую половину эволюции. с.Мы удалили это предложение вместе с последним предложением абзаца, и мы думаем, что сокращенный абзац теперь представляет более сбалансированное обсуждение: наши данные согласуются с предыдущими данными (включая Gerstein et al., 2011), показывающими более быструю адаптацию у диплоидов, которая может быть полностью из-за эффектов доминирования, но также может быть частично из-за широко распространенных моделей снижения адаптивности, вызванных глобальным эпистазом убывающей отдачи. Мы также попытались сбалансировать формулировку этого предложения, которое появляется позже по тексту:

«Таким образом, более медленная скорость увеличения приспособленности диплоидов может быть частично или полностью следствием убывающей отдачи (Chou et al., 2011; Хан и др., 2011; Кряжимский и др., 2014) ».

6) Подраздел «Молекулярная эволюция» и другие разделы - Во всех сравнениях с результатами предыдущих результатов (особенно LTEE), пожалуйста, укажите поколение, на котором может быть выполнено сравнение (в идеале 10 000). Результаты LTEE, которые появились намного позже, не отличаются от текущего эксперимента. Об этом говорится в Обсуждении, но это необходимо при первом упоминании.
Артикул:
Герштейн, А.К., Чун, Х. Дж. Э., Грант, А., Отто, С. П. (2006). Геномная конвергенция к диплоидии у Saccharomyces cerevisiae. PLoS генетика, 2 (9), e145.
Герштейн, А.С., Клеатеро, Л.А., Мандегар, М.А., и Отто, С.П. (2011). Гаплоиды адаптируются быстрее, чем диплоиды, в различных средах. Журнал эволюционной биологии, 24 (3), 531-540.
Харари Ю., Рам Ю., Раппопорт Н., Хадани Л. и Купец М. (2018). Спонтанные изменения плоидности у дрожжей обычны. Current Biology, 28 (6), 825-835.
Линч, М., Акерман, М.С., Подагра, Дж. Ф., Лонг, Х., Сунг, В., Томас, В. К., и Фостер, П. Л. (2016). Генетический дрейф, отбор и эволюция скорости мутаций. Nature Reviews Genetics, 17 (11), 704.
.

Все сравнения, сделанные с помощью LTEE, производятся на уровне 10 000 поколений, и мы добавили фразы и ссылки к основному тексту, чтобы отразить это для каждого сравнения.

Рецензент № 3:
1) Пожалуйста, четко укажите, как рассчитываются поколения.Обновляется ли это оценочное количество поколений в неделю на каждой среде с эмпирическими результатами анализов пригодности? Или просто предполагается, что оно останется постоянным?

Мы добавили ссылку на тот факт, что коэффициент разведения определяет номера поколений: «Эти разведения определяют количество удвоений или поколений в день (10 для YPD 30 ° C и SC 30 ° C, 8 для SC 37 ° C)» .

2) Пожалуйста, поясните причину изменения эталонного напряжения для расчета пригодности в разных средах в тексте.(Предположительно, беспокойство по поводу чувствительности тестов пригодности при различных абсолютных показателях приспособленности.)

Мы объясняем это решение в Материалах и методах: «Чтобы оценить конкурентоспособность, используя постоянный эталон для каждой среды, мы выделили клоны в различных поколениях из произвольно выбранной развивающейся диплоидной популяции при YPD 30 ° C (P1G09). Мы искали клоны, которые имели промежуточную пригодность между предковыми штаммами и эволюционировавшими штаммами в каждой среде, и пометили эти клоны, вставив кассету yNatMX… »

3) В конкурентных тестах пригодности более идеально иметь оба штамма, помеченные флуоресцентным маркером по той причине, что авторы выделяют флуоресцентные генотипы, как правило, производят небольшое нефлуоресцентное подмножество в популяции - но, учитывая схему здесь, анализ с одним отмеченным штаммом в порядке.Я упускаю некоторые подробности в приложении о природе расчетов пригодности, и похоже, что авторы не предоставили необработанные соотношения данных проточной цитометрии, используемых для расчета приспособленности. Доступность кода для анализа этих данных отмечена в документе «Прозрачная отчетность», но было бы полезно сделать информацию более заметной в тексте рукописи.

Теперь мы включили необработанные подсчеты для ячеек в контрольные ворота вместе с вычисленными нескорректированными и скорректированными референсными частотами в каждом образце в Дополнительный файл 1 на листе «Подсчеты фитнес-анализа», и мы отмечаем, что заинтересованные читатели могут посмотреть на графики необработанного флуоресценции и стробирования в интерактивном браузере, размещенном по адресу https: // www.miloswebsite.com/exp_evo_browser.

4) Соответственно, на Рисунке 2 - добавление к рисунку 2, похоже, есть набор штаммов в среде SC 37 ° C, которые показали низкую пригодность в повторении 2 по сравнению с повторением 1. Это не обязательно проблематично, учитывая масштаб анализ представлен здесь, но в том виде, в каком он написан, рукопись несколько непонятна в отношении того, какие именно технические (или биологические) вариации могут способствовать этому шаблону. Пожалуйста, уточните, предоставив исходные данные о пригодности и / или устраняя это небольшое несоответствие напрямую.

Мы предоставили объяснение этого отклонения от линии корреляции реплик 1: 1 в тексте «Материалы и методы». Мы считаем, что основная проблема заключается в том, что незначительные пакетные эффекты, вероятно, вызванные двумя разными машинами, используемыми для двух реплик, имеют чрезмерный эффект, когда эталонные частоты быстро растут (в популяциях с низкой пригодностью). Текст добавленных материалов и методов гласит:

«Хотя наши повторные измерения фитнеса в целом очень хорошо коррелируют (Рисунок 2 - рисунок в приложении 1), существует отклонение от линии 1: 1 для повторных измерений фитнеса для популяций с низким уровнем фитнеса при SC 37 ° C.[…] Только анализы, в которых референсная частота растет очень быстро (популяции с низкой пригодностью), сильно подвержены влиянию ».

5) Читателям может быть полезно аннотировать путь на рисунке 7A с частотой мутаций в каждом гене.

Спасибо за это предложение, мы внесли это изменение.

6) Большинство наблюдаемых полезных реверсий стоп-кодона ade2 приходится на диплоиды. Авторы приводят доводы в пользу целевого размера реверсии стоп-кодона (vs.попадание в другие части пути), что влияет на частоту, с которой популяции обнаруживают пик функциональной пригодности ADE. Имеет ли значение разница в размере цели для гаплоидов и диплоидов?

Мы думаем, что этот комментарий относится к тому факту, что диплоиды и гаплоиды имеют две и одну копию ADE2 соответственно. Это различие будет иметь значение в том случае, если процесс нахождения пика функциональной приспособленности ADE был полностью ограничен мутациями, но важной динамикой здесь, как отмечает рецензент, является относительная скорость перехода к пику функциональной приспособленности ADE или более низкому значению. состояние пригодности, связанное с мутациями выше по течению пути.Следовательно, мы считаем, что ключевое различие между гаплоидами и диплоидами с точки зрения эволюционного результата - это преобладание мутаций в двух путях. Это различие можно было бы сформулировать как проблему «целевого размера», если мы будем использовать этот термин в широком смысле, который включает скорость потери гетерозиготности у диплоидов: в этом случае целевые размеры двух эволюционных путей больше похожи на друг друга в диплоидах, чем в гаплоидах. Однако мы думаем, что такое широкое использование размера цели сбивает с толку многих читателей, поэтому мы решили оставить наше первоначальное обсуждение, в котором проводится различие с точки зрения доминирования и сита Холдейна.

7) Было бы полезно дать читателям краткое описание вывода взаимной информации.

Мы добавили более подробное описание вывода взаимной информации, которое непосредственно следует за Fisher et al., 2019. См. Подраздел «Анализ взаимной информации» в измененном тексте. Обратите внимание, что, поскольку мы повторно выполняем моделирование, связанное с нашим анализом, статистические результаты этого анализа, наряду с результатами нашего анализа сверхдисперсии, очень немного отличаются от исходного черновика (но результаты не изменились).

Наконец, мы хотели бы отметить, что мы внесли несколько незначительных изменений на основе отзывов коллег, которые читали препринт. Примечательно, что мы добавили rad5-535 к зарегистрированному генотипу штамма и исправили ошибку записи, в которой наши поколения для SC 37 ° C отличались друг от друга на 2 поколения.

https://doi.org/10.7554/eLife.63910.sa2

обновленная платформа для реконструкции высококачественных метаболических моделей в масштабе генома

% PDF-1.5 % 1 0 объект > / Метаданные 321 0 R / Страницы 2 0 R / StructTreeRoot 3 0 R / Тип / Каталог >> эндобдж 321 0 объект > поток заявка / pdf

M.Бернардес Сильва

merlin v4.0: обновленная платформа для реконструкции высококачественных моделей метаболизма в масштабе генома

2021-02-24T21: 00: 33ZMicrosoft® Word 20132021-07-28T13: 16: 53-07: 002021-07-28T13: 16: 53-07: 00 Microsoft® Word 2013uuid: 57c9f364-1dd2-11b2-0a00-b80927bd3700uuid: 57c9f36b-1dd2-11b2-0a00-5b0000000000 конечный поток эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 110 0 объект > эндобдж 111 0 объект > эндобдж 113 0 объект [132 0 R 133 0 R 134 0 R 134 0 R 134 0 R 134 0 R 134 0 R 135 0 R 136 0 R 136 0 R 136 0 R 136 0 R 136 0 R 136 0 R 136 0 R 136 0 R 137 0 R 137 0 R 137 0 R 137 0 R 137 0 R 137 0 R 137 0 R 137 0 R 138 0 R 139 0 R] эндобдж 114 0 объект [140 0 R 141 0 R 142 0 R 143 0 R 144 0 R 145 0 R 146 0 R 147 0 R] эндобдж 115 0 объект [148 0 R 149 0 R 151 0 R 152 0 R 153 0 R 154 0 R 150 0 R] эндобдж 116 0 объект [155 0 R 156 0 R 157 0 R 158 0 R 159 0 R 160 0 R 161 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R 162 0 R] эндобдж 117 0 объект [163 0 R 164 0 R 165 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 166 0 R 167 0 R 168 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 169 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 170 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 170 0 R 171 0 R] эндобдж 118 0 объект [172 0 R 173 0 R 174 0 R 175 0 R 176 0 R 177 0 R 178 0 R 179 0 R 180 0 R] эндобдж 119 0 объект [181 0 R 182 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 183 0 R 184 0 R 185 0 R 186 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 187 0 R 187 0 R 187 0 R 187 0 R 188 0 R 189 0 R 190 0 R 191 0 R] эндобдж 120 0 объект [319 0 R 318 0 R 193 0 R 194 0 R 195 0 R] эндобдж 121 0 объект [196 0 R 197 0 R 198 0 R 199 0 R 200 0 R 201 0 R] эндобдж 122 0 объект [202 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 203 0 R 204 0 R 205 0 R 206 0 R 207 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R] эндобдж 123 0 объект [209 0 R 210 0 R 211 0 R 212 0 R 213 0 R] эндобдж 124 0 объект [214 0 R 214 0 R 214 0 R 214 0 R 214 0 R 214 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 216 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 217 0 R 218 0 R 219 0 R 220 0 R] эндобдж 125 0 объект [221 0 R 222 0 R 223 0 R 224 0 R 225 0 R 226 0 R 227 0 R 228 0 R 229 0 R 230 0 R 231 0 R] эндобдж 126 0 объект [232 0 R 233 0 R 234 0 R 235 0 R 236 0 R 237 0 R 238 0 R 239 0 R 240 0 R 241 0 R 242 0 R 243 0 R 244 0 R 245 0 R 246 0 R 247 0 R 248 0 R] эндобдж 127 0 объект [249 0 R 250 0 R 251 0 R 252 0 R 253 0 R 254 0 R 255 0 R 256 0 R 257 0 R 258 0 R 259 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 261 0 R 262 0 R 263 0 R 264 0 R] эндобдж 128 0 объект [265 0 R 266 0 R 267 0 R 268 0 R 269 0 R 270 0 R 271 0 R 272 0 R 273 0 R 274 0 R 275 0 R 276 0 R 277 0 R 278 0 R 279 0 R 280 0 R] эндобдж 129 0 объект [281 0 R 282 0 R 283 0 R 284 0 R 285 0 R 286 0 R 287 0 R 288 0 R 289 0 R 290 0 R 291 0 R 292 0 R 293 0 R 294 0 R 295 0 R] эндобдж 130 0 объект [296 0 R 297 0 R 298 0 R 299 0 R 300 0 R 301 0 R 302 0 R 303 0 R 304 0 R 305 0 R 306 0 R 307 0 R 308 0 R 309 0 R 310 0 R 311 0 R] эндобдж 131 0 объект [312 0 R 313 0 R 314 0 R 315 0 R 316 0 R 317 0 R] эндобдж 312 0 объект > эндобдж 313 0 объект > эндобдж 314 0 объект > эндобдж 315 0 объект > эндобдж 316 0 объект > эндобдж 317 0 объект > эндобдж 112 0 объект > эндобдж 22 0 объект > / MediaBox [0 0 595.